研究簡介:海草草甸是水生環(huán)境中重要的生態(tài)系統(tǒng)。海草草甸是高產(chǎn)棲息地，維持著無脊椎動物、魚類和海洋哺乳動物的高度生物多樣性，并且是幼魚的重要繁殖地。沿海富營養(yǎng)化是對海草生態(tài)系統(tǒng)的主要威脅。它刺激海草葉子上的附生植物過度生長，影響葉子微環(huán)境，導致植物出現(xiàn)極端的葉子理化條件。附生生物膜中微生物群落的活動是驅動海草葉際動態(tài)的重要因素，其中附生植物呼吸和光合作用強烈影響海草葉微環(huán)境內必需溶質和氣體的濃度，并且微生物競爭溶解的無機物白天大量消耗碳，夜間大量消耗氧氣，導致附生生物量和海草光合作用之間往往呈負相關關系。附生植物還可以阻礙葉表面的水流，阻礙湍流運輸，并通過分子擴散減緩海草葉與周圍水之間的溶質交換。附生植物層厚度與附生植物/海水界面上方的擴散邊界層（DBL）厚度一起構成總擴散距離（TDD）。有附生植物的葉子上的TDD比裸葉大得多（通常厚10倍），因此延長了分子擴散時間并限制了海草葉子與周圍水體之間的養(yǎng)分和氣體交換。高O2和低CO2水平增強了促進光呼吸的RuBisCO加氧酶活性，從而進一步降低了海草葉片的光合效率。然而附生生物膜的生物活性在多大程度上有助于葉際動力學并影響海草葉的光合作用和無機碳可用性仍然很大程度上未知。在本研究中，研究人員使用預先滅菌的瓊脂基質來模擬海草葉子上的“非活性”附生生物膜，該生物膜阻礙了傳質，但不具有微生物活性。比較了相似厚度的天然“活性”和人造“非活性”生物膜，以區(qū)分附生微生物活性和傳質阻抗對海草葉片光合作用和呼吸以及無機碳有效性的影響。我們還對裸露的海草葉子和去除附生生物膜的葉子進行了比較測量。

Unisense微電極研究系統(tǒng)的應用

使用unisense的O2和pH微電極傳感器來測量濃度梯度并計算海草葉子周圍的化學通量。將氧氣和pH微電極傳感器、參考電極連接到多通道微傳感器主機上（Unisense A/S，丹麥），并將微傳感器安裝在電動顯微馬達控制器系統(tǒng)（Unisense A/S，丹麥）上。多通道微傳感器系統(tǒng)和微操縱器都連接到電腦上，其中數(shù)據(jù)采集和傳感器定位通過軟件（SensorSuite Profiler v3.2，Unisense A/S，丹麥）進行控制。微傳感器的定位是相對于海草葉表面的，這是通過手動操作顯微操縱器同時通過立體顯微鏡觀察葉表面和微傳感器尖端來確定的。

實驗結果

研究發(fā)現(xiàn)附生生物膜中的微生物活性主要影響海草葉在光下的化學微環(huán)境導致高O2和pH條件以及無機碳的強烈消耗，從而導致海草植物的低碳可用性。此外去除附生植物的葉子產(chǎn)生的氧氣比裸葉少，因此表現(xiàn)出較低的光合作用能力。在堿化葉際中，CO2濃度相對較低，對能量HCO3-利用的需求增加，限制了葉片的光合作用，而O2高而低。細胞內CO2濃度會增加光呼吸，進一步降低光合效率。在富營養(yǎng)化的沿海水域，帶有附生生物膜的海草葉子過度生長，導致TDD較厚和微生物活性較強，從而導致海草葉子化學微環(huán)境發(fā)生劇烈的晝夜變化，對海草性能產(chǎn)生負面影響，因此對海草構成潛在危害健身和重要的生態(tài)系統(tǒng)功能。

圖1、實驗設置圖。(A)固定在顯微鏡載玻片上的裸露海草葉（綠色）和附生植物葉（棕色）的示例。(B)立體顯微鏡前的流動室中的葉子碎片，以及安裝在海草葉子樣本上方的電動顯微操作器上的微傳感器。(C)將裸露的海草葉子和去除附生植物的葉子放入由載玻片制成的定制模具中，以成型并確定瓊脂封裝的體積/高度。

圖2、在黑暗條件下測量帶有附生植物(epi)的海草葉子和去除附生植物(epi-removed)并用瓊脂覆蓋的葉子(A)以及裸露葉子和去除附生植物的葉子(B)的氧氣濃度分布（0μmol光子m-2 s-1）和光（230μmol光子m-2 s-1）。虛線表示總擴散距離（即葉子、生物膜或老化物的表面+擴散邊界層）。

圖3、在帶有附生植物(epi)的海草葉子和去除附生植物(epi-removed)并用瓊脂覆蓋的葉子(A)以及裸葉和在黑暗中去除附生植物的葉子(B)上測量的pH曲線（0μmol光子m-2 s-1）和光（230μmol光子m-2 s-1）。虛線表示總擴散距離（即葉子、生物膜或老化物的表面+擴散邊界層）。

圖4、帶有附生植物(epi)的海草葉子和去除附生植物(epi-removed)并用瓊脂覆蓋的葉子(A)以及裸露葉子和帶有附生植物的葉子上計算的CO2分布在黑暗（0μmol光子m-2 s-1）和光（230μmol光子m-2s-1）中移除(B)。誤差線表示SEM；n=15（使用Epi、去除Epi和去除Epi+瓊脂進行復制），n=12（裸葉）。根據(jù)測得的pH微分布和海水中總DIC測量值計算得出。

圖5、海草葉表面測量的O2通量(A)，估計的碳通量為葉表面CO2和HCO3?通量之和(B)，在黑暗中（0μmol光子m-2 s-1，藍色）和光（230μmol光子m-2 s-1，橙色）。誤差線表示根據(jù)Student t分布的95%置信水平的置信區(qū)間；n=15（使用Epi、去除Epi和去除Epi+瓊脂進行復制），n=12（裸葉）。正值表示流出，負值表示穿過相應界面的流入。請注意，在圖b中，由于pH微傳感器的空間分辨率有限（平均值已標記），實際上不可能計算除去附生植物的葉子和裸葉的總碳通量，兩者的DBL都非常薄。

結論與展望

本論文研究了海草葉子上的附生生物膜可能會導致封裝葉子的極端微環(huán)境條件限制其光合作用和呼吸作用。然而人們對生物膜本身的生物活性如何改變海草葉際微環(huán)境和動態(tài)知之甚少。研究人員使用unisense微電極剖面系統(tǒng)測量了O2濃度和pH梯度，并計算覆蓋有人工、非活性生物膜和天然附生生物膜的海草葉周圍O2、CO2和碳酸氫鹽的通量。研究人員比較了“活性”和“非活性”生物膜的O2和無機碳的濃度分布和通量，以研究海草葉生物膜中微生物活性和分子擴散的影響。在光照下，生物膜不活躍的葉片O 2通量僅為生物膜活躍葉片的31%，表明生物膜內微生物群落的光合作用占了O2濃度分布和O2通量幾乎相同。在光照下“活性”生物膜的pH值增加了約1.0，“非活性”生物膜的pH值增加了約0.3個單位，并且與在黑暗中相比，兩者都顯示出約0.3個pH單位的下降。通過測量表明附生植物層中強烈的光合作用驅動了葉際堿化和無機碳限制。與葉表面CO 2濃度13.8μmol相比，計算得出的葉表面附生生物膜中CO2濃度在光照下降低至0.09μmol·L-1 L-1，裸露海草葉片上的CO2流入量僅為O 2流出量的3.0%和5.4%。光流入量占海草葉總無機碳流入量的91-97%，盡管通過CO2利用集中機制是消耗能量的。除了增加傳質阻抗外，葉附生生物膜活性還通過誘導更高的O 2濃度和pH、增加CO2限制并降低葉光合作用效率，強烈影響光下海草葉的微環(huán)境。