研究簡介:隨著核技術(shù)在能源生產(chǎn)、醫(yī)療和工業(yè)應(yīng)用中的廣泛使用，人們越來越關(guān)注輻射對人體健康的影響。電離輻射對生物體的損傷主要通過兩種方式產(chǎn)生：直接作用和間接作用。直接作用是指輻射直接與生物大分子相互作用，而間接作用則是指輻射首先與水分子作用，產(chǎn)生具有高反應(yīng)性的自由基，如羥基自由基(.OH)，這些自由基隨后與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。在眾多的自由基中，羥基自由基(.OH)因其高反應(yīng)性而被認(rèn)為是輻射誘導(dǎo)損傷的主要介質(zhì)。盡管已有一些輻射防護(hù)劑，如硫醇化合物氨磷汀(WR-2721)，但它們通常伴隨著副作用，限制了在臨床上的應(yīng)用。因此，尋找一種安全有效的輻射防護(hù)劑成為了一個重要的研究課題。氫氣(H2)因其獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，如高擴(kuò)散性和選擇性抗氧化能力，被認(rèn)為是一種潛在的輻射防護(hù)劑。氫氣可以選擇性地減少細(xì)胞毒性活性氧(ROS)，如.OH和過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)，而不干擾生理上重要的氧化還原反應(yīng)。此外，氫氣在體內(nèi)外均顯示出治療性抗氧化活性，且沒有已知的毒副作用。本研究旨在探討氫氣對輻照生殖細(xì)胞的保護(hù)作用及其潛在的輻射防護(hù)機(jī)制。研究者們使用了富氫鹽水，通過高壓將氫氣溶解在生理鹽水中，制備出用于實驗的溶液。

通過一系列實驗，包括自旋捕獲技術(shù)、羥基苯基熒光素(HPF)熒光探針檢測、生化檢測和細(xì)胞凋亡測定等方法，研究者們評估了氫氣對輻射誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞損傷的保護(hù)效果。研究結(jié)果表明，氫氣能夠顯著降低輻射過程中產(chǎn)生的羥基自由基水平，減少脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)羰基化和DNA氧化損傷，從而減輕輻射對小鼠睪丸的損傷。此外，氫氣還顯示出對生殖細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，維持了干精原細(xì)胞的活力。

Unisense微電極測定系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極被用于測定小鼠體內(nèi)氫氣（H2）的濃度。首先將富氫鹽水注射到小鼠體內(nèi)，然后使用Unisense氫氣微電極測量了注射后小鼠睪丸中的氫氣濃度。通過測量老鼠體內(nèi)氫氣濃度，能夠探討氫氣如何通過減少羥基自由基（.OH）的產(chǎn)生來發(fā)揮輻射防護(hù)作用。

實驗結(jié)果

研究結(jié)果表明，氫氣能夠顯著降低輻射過程中產(chǎn)生的羥基自由基水平，減少脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)羰基化和DNA氧化損傷，從而減輕輻射對小鼠睪丸的損傷。此外，氫氣還顯示出對生殖細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，維持了干精原細(xì)胞的活力。氫氣處理改善了輻射引起的睪丸組織形態(tài)學(xué)變化，并減少了通過TUNEL檢測到的凋亡現(xiàn)象，表明氫氣對生殖細(xì)胞具有保護(hù)作用。與現(xiàn)有的輻射防護(hù)劑（如WR-2721）相比，氫氣沒有顯示出任何已知的毒副作用，這使其成為一種潛在的安全防護(hù)手段。

圖1、自旋捕獲識別了H2還原的.OH。(A)在無細(xì)胞體系中，H2溶解在23℃和pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(10mM)溶液中，過飽和富氫鹽水(0.8mM)稀釋至0.4和0.2mM。作為.OH與DMPO的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，在35mM DMPO的存在下，在0.1mM H2O2和0.03mM亞鐵的混合物中通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生.OH，并將溶液置于ESR測量儀(EMX-8)中進(jìn)行測量。為了獲得不同濃度H2下.DMPO-OH自由基的光譜，ESR掃描了30秒，累計六次。(B)對每個獨立組的.DMPO-OH自由基信號進(jìn)行半定量分析，以對照組百分比的第二個峰值表示。

圖2、使用HPF檢測H2O放射性分解產(chǎn)生的.OH。(A)輻射劑量與輻射溶解中熒光增加之間的關(guān)系。在無細(xì)胞體系中，將HPF探針[最終濃度為10μM，0.1%DMF(二甲基甲酰胺)作為輔助溶劑]加入23℃和pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，分別用5、10和20Gy劑量的γ-射線照射，照射速度為2Gy/min，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用熒光顯微鏡獲取熒光圖像。熒光強(qiáng)度是在515nm波長和490nm波長的激發(fā)下測定的。基線顯示的是沒有HPF時的熒光。(B)熒光強(qiáng)度由每個獨立組(n=3)的試樣進(jìn)行半定量。

圖3、腹腔注射富氫鹽水可增加睪丸中的H2濃度。經(jīng)腹腔注入0.01ml/g的富氫生理鹽水。用水合氯醛(0.35mg/g)麻醉小鼠，使其仰臥。將H2微電極(直徑50μm)插入睪丸300μm深處。注入睪丸后5min和10min(相對于0min)，H2濃度(μM)增加(n=6)。

圖4、腹腔注射富含氫氣的生理鹽水可降低IR期間的.OH水平。(A)在5Gy劑量輻射前20min，麻醉小鼠睪丸內(nèi)注射HPF(15μl，25μM)，輻射前5min腹腔注射富氫鹽水(0.01ml/g)。照射后，迅速從麻醉小鼠體內(nèi)取出組織，包埋在OCT復(fù)合物中，準(zhǔn)備冷凍切片(8μm厚切片)。用熒光顯微鏡獲得具有代表性的睪丸熒光圖像?；€1和2顯示了有輻射時(1)和無輻射時(2)的熒光(在沒有HPF和H2的情況下)。(B)在每個獨立實驗中，對冷凍切片中的HPF熒光進(jìn)行半定量分析。通過比較不同組間睪丸的相對熒光強(qiáng)度來分析獲得的圖像(n=6)。

圖5、H2保護(hù)睪丸內(nèi)源性抗氧化劑，減少紅外線對睪丸的氧化損傷。(A)5Gy劑量輻射4小時后，非輻射對照組、僅H2組、輻射+生理鹽水組和輻射+H2組SOD活性和GSH濃度的變化。(B)用夾心ELISA免疫反應(yīng)評估5Gy劑量照射4小時后未照射對照組、僅H2組、輻射+生理鹽水組和輻射+H2組中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA中氧化應(yīng)激的標(biāo)記物，如MDA、蛋白質(zhì)羰基和8-OHdG(n=6)。

結(jié)論與展望

H2(氫氣)具有作為一種新型輻射防護(hù)劑的潛力，而且沒有已知的毒副作用。本研究旨在探討H2的潛在輻射防護(hù)機(jī)制及其對輻照生殖細(xì)胞的保護(hù)作用。通過芬頓反應(yīng)和H2O的輻射分解產(chǎn)生的羥自由基(.OH)被確定為被H2還原的自由基物種。研究人員使用了unisense的H2微電極動態(tài)檢測體內(nèi)H2的濃度，發(fā)現(xiàn)H2能顯著降低羥苯基熒光素的原位熒光強(qiáng)度。由于Unisense微電極是一種高精度的傳感器，能夠準(zhǔn)確測量溶解在溶液或生物組織中的氣體濃度。通過測量注射富氫鹽水后小鼠睪丸中氫氣的濃度，研究者能夠評估氫氣對輻射誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞損傷的保護(hù)效果。這是因為氫氣的濃度可能與其抗氧化和輻射防護(hù)能力直接相關(guān)。但是由于在照射后用H2處理小鼠，因此降低的幅度并不明顯。研究發(fā)現(xiàn)將H2預(yù)處理為IR(電離輻射)可明顯抑制。OH與細(xì)胞大分子的反應(yīng)，這種反應(yīng)會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)羰基和DNA氧化損傷。通過睪丸組織形態(tài)學(xué)變化和TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP nick-end標(biāo)記)檢查發(fā)現(xiàn)的凋亡現(xiàn)象有所改善，以及通過睪丸組織學(xué)參數(shù)、每日精子生成量和精子質(zhì)量檢查發(fā)現(xiàn)的干精原細(xì)胞存活率保持不變，都證明了H2對男性生殖細(xì)胞的輻射保護(hù)作用。使用WR-2721[S-2-(3-氨基丙基氨基)乙基硫代磷酸]作為參考化合物。研究結(jié)果首次在體內(nèi)證明了H2通過中和輻照組織中的-OH起到輻射保護(hù)作用，且無副作用。這項研究首次在體內(nèi)證明了氫氣通過中和輻照組織中的羥基自由基起到輻射保護(hù)作用，且無副作用。這一發(fā)現(xiàn)為氫氣作為輻射防護(hù)劑的潛在應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)，并為未來保護(hù)暴露于輻射環(huán)境下的男性生育能力提供了新的策略。