研究簡介:胍是一種在自然界中廣泛存在并且在人類尿液中排泄的化學(xué)穩(wěn)定的氮化合物，它也被用于塑料制造、作為阻燃劑和推進(jìn)劑的成分，在生物化學(xué)中作為蛋白質(zhì)變性劑而知名。研究人員通過蛋白質(zhì)組學(xué)、酶動力學(xué)和晶體結(jié)構(gòu)分析等方法，揭示了N.inopinata中胍酶的活性和作用機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)，這種微生物能夠通過一個(gè)高效的途徑將胍轉(zhuǎn)化為氨，這一途徑不依賴于ATP（三磷酸腺苷），使其比其他已知使用胍作為氮源的微生物更有能量效率。在農(nóng)業(yè)土壤和廢水處理廠的微生物群落中，胍可以作為硝化作用的底物。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解comammox在氮循環(huán)中的作用提供了新的視角，也為開發(fā)新的生物技術(shù)提供了可能性，例如在廢水處理和農(nóng)業(yè)土壤管理中利用comammox微生物來提高氮的利用效率。探討了胍代謝在環(huán)境中的潛在應(yīng)用，包括在廢水處理廠中去除廣泛使用的藥物如二甲雙胍（一種治療2型糖尿病的藥物）的環(huán)境殘留。二甲雙胍的降解產(chǎn)物之一就是胍，因此comammox微生物可能在環(huán)境中的胍循環(huán)中發(fā)揮重要作用。本研究給出了一個(gè)突破性的發(fā)現(xiàn)：一種名為Nitrospira inopinata的完全氨氧化微生物（comammox）能夠利用胍作為其唯一的能量、還原劑和氮源進(jìn)行生長。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微呼吸系統(tǒng)被用于測量和監(jiān)測全細(xì)胞底物氧化動力學(xué)。unissense的微呼吸測量是一種用于評估微生物細(xì)胞對特定底物（如胍、尿素或氨）氧化能力的技術(shù)。使用O2 MicroOptodes和MicroOptode meter（Opto-F4 UniAmp），能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測在微呼吸實(shí)驗(yàn)中氧氣濃度的變化。向含有N.inopinata細(xì)胞的MR室中注射不同的底物（如胍、尿素或氨），測量細(xì)胞對這些底物的氧化速率，并通過氧氣消耗來推斷。。通過監(jiān)測氧氣的消耗，使用Michaelis-Menten模型來計(jì)算如Km(app)（表觀半飽和常數(shù)）和Vmax（最大反應(yīng)速率）等動力學(xué)參數(shù)。在氨氧化過程中添加不同濃度的胍，評估了胍對氨氧化速率的抑制效應(yīng)。測量細(xì)胞在不同底物條件下的氧氣攝取率，可以分析細(xì)胞的代謝活性和對不同底物的利用效率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

發(fā)現(xiàn)了一種全新的微生物代謝途徑，即完全氨氧化微生物（comammox）Nitrospira inopinata能夠利用胍作為其生長的唯一能源、還原劑和氮源。表明comammox微生物在氮循環(huán)中可能扮演著重要角色，尤其是在胍含量豐富的環(huán)境中。胍的代謝為comammox提供了一個(gè)額外的生態(tài)位，有助于它們與其他氨氧化微生物共存。胍作為一種潛在的硝化微生物生長基質(zhì)，可能有助于開發(fā)新的生物技術(shù)，在廢水處理和農(nóng)業(yè)土壤管理中提高氮的利用效率，以及在去除環(huán)境中的二甲雙胍等藥物殘留方面發(fā)揮作用。研究補(bǔ)充了對氨氧化微生物能量來源和代謝途徑的理解，特別是對于comammox微生物的生態(tài)重要性和它們在自然界中的分布。

圖1、胍降解所涉及的途徑和基因。a)胍羧化酶途徑。AH，脲基甲酸酯水解酶；CD，羧基胍脫氨酶；氣體、胍酶；GC，胍羧化酶；P i，無機(jī)磷酸鹽；用途，脲酶。b）胍酶途徑。c）在comammox微生物N.inopinata、AOB Nitrosospira multiformis和兩種用于胍分解代謝的細(xì)菌模型生物中，編碼參與在I型胍核糖開關(guān)調(diào)節(jié)下的胍降解的蛋白質(zhì)的基因的排列。

圖2、comammox胍酶的系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)。a，尿素水解酶超家族的系統(tǒng)發(fā)育。圓圈表示具有功能特征的成員。所表征的N 1-氨基丙基胍丁胺酶包含在指定的胍丁胺酶進(jìn)化枝中?；疑种Р粚?yīng)于任何已知的功能，或者對于功能來說不是單系的。b，簡化的胍酶系統(tǒng)發(fā)育，使用生化特征的精氨酸酶家族成員作為外群（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4a中顯示了完整的樹）。根據(jù)先前的研究（N.inopinata胍酶位置Thr105、His222、Trp313和Glu344；補(bǔ)充表4），顯示了可能對胍催化重要的特定氨基酸殘基。c，comammox胍酶（氨基酸）和氨單加氧酶（amoA核苷酸）的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的比較。同一基因組中發(fā)現(xiàn)的基因的樹尖相連。d，胍丁酶的靜電表面表示（從?5 kT/e（紅色）到+5 kT/e（藍(lán)色）），其中突出顯示了通往活性位點(diǎn)的隧道的建議入口（左）。右圖是方框所示區(qū)域的放大圖。由CAVER 57確定的隧道顯示為綠線，其寬度由點(diǎn)表示表示?；钚晕稽c(diǎn)殘基顯示為棒，鎳(Ni)和錳(Mn)離子分別顯示為綠色和紫色球體。胍顯示為棒，相應(yīng)的范德華原子半徑表示為點(diǎn)。

圖3、N.inopinata在以胍為唯一能源、還原劑和氮的情況下生長。a，隨著時(shí)間的推移，胍的生物降解。將約50μM(150μM N)同位素標(biāo)記的胍添加到N.inopinata的洗滌培養(yǎng)物中（與胍和銨預(yù)孵育1個(gè)月后），并孵育126天。使用高壓滅菌的N.inopinata生物質(zhì)來控制非生物胍腐爛。在第84天和第112天，將大約50μM的胍額外添加到活生物質(zhì)培養(yǎng)物中（灰色虛線）。銨從未增加到檢測水平(5μM)以上，尿素濃度保持在2.5μM以下。b、NO 2-和NO 3-產(chǎn)量（組合）。孵育結(jié)束時(shí)，添加的胍氮總量的78%被氧化為NO 2-和NO 3-。氮平衡顯示在擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3f中。c，16S rRNA基因拷貝數(shù)的qPCR分析。使用韋爾奇雙樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；***P=0.0049，t=10.348，df=4，比較在126天時(shí)間點(diǎn)使用胍與不使用胍孵育的N.inopinata細(xì)胞數(shù)量。對于a–c，數(shù)據(jù)是五個(gè)生物重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。d、e，用胍(d)和不含胍(e)孵育107天后DAPI染色的N.inopinata細(xì)胞（紅色，10 ml培養(yǎng)物過濾到0.2μm GTTP過濾器上）的代表性圖像。所有五個(gè)生物復(fù)制都觀察到相同的結(jié)果。f，g，N.inopinata細(xì)胞與15 N-胍和13 C-碳酸氫鹽孵育107天后的氮(f)和相應(yīng)的碳(g)同位素富集（使用nanoSIMS測量）。通過用來自頂空空氣的CO 2稀釋13 C-碳酸氫鹽、丙酮酸鹽形成CO2以及介質(zhì)中同位素未標(biāo)記的胍的分解來降低13 C-富集。顯示了來自一個(gè)生物復(fù)制的數(shù)據(jù)。

圖4、純化的胍酶和N.inopinata細(xì)胞的胍氧化動力學(xué)。a，異源表達(dá)的N.inopinata胍酶的動力學(xué)特征。Michaelis-Menten模型（紅線）適合胍酶（pH 7.5，37°C）的三次胍消耗率，并用于確定K m和V max。b，用微傳感器測量用胍預(yù)誘導(dǎo)約12小時(shí)的細(xì)胞，確定N.inopinata的全細(xì)胞胍氧化率。Michaelis-Menten模型（紅線）用于根據(jù)胍氧化速率確定表觀半飽和常數(shù)(K m(app))、V max和底物特異性親和力。

圖5、a、b）來自Ribe(a)和Haderslev(b)污水處理廠的大量comammox生物體中，胍APC超家族通透酶(APCP)和胍酶對底物加標(biāo)（胍、銨、尿素）孵育的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Ribe和Haderslev實(shí)驗(yàn)的宏轉(zhuǎn)錄組讀數(shù)分別映射到Ribe和Haderslev comammox MAG；TPM中顯示了所有時(shí)間點(diǎn)感興趣基因的轉(zhuǎn)錄水平。c、d，Ribe(c)和Haderslev(d)采樣時(shí)用于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的重復(fù)中相應(yīng)的胍濃度。

結(jié)論與展望

胍是一種化學(xué)穩(wěn)定的氮化合物，可通過人體尿液排出，廣泛用于塑料制造、作為阻燃劑和推進(jìn)劑的成分，并且在生物化學(xué)中作為蛋白質(zhì)變性劑而廣為人知。胍在自然界中廣泛存在，并被多種微生物用作氮源，但以胍作為唯一底物生長的微生物尚未被鑒定。研究發(fā)現(xiàn)完全氨氧化劑（comammox）Nitrospira inopinata和可能大多數(shù)其他comammox微生物可以依靠胍作為唯一的能量、還原劑和氮源生長。N.inopinata胍酶同源物的蛋白質(zhì)組學(xué)、酶動力學(xué)和晶體結(jié)構(gòu)證明它是真正的胍酶。Unisense微呼吸系統(tǒng)被用于測量和監(jiān)測全細(xì)胞底物氧化動力學(xué)，該技術(shù)的使用使得研究人員能夠精確地測量微生物對特定底物的代謝反應(yīng)，并進(jìn)一步了解微生物的代謝途徑和生態(tài)功能。Unisense微呼吸系統(tǒng)對于揭示N.inopinata如何利用胍作為能量、還原劑和氮源進(jìn)行生長具有關(guān)鍵作用。再對含有comammox的農(nóng)業(yè)土壤和廢水處理廠微生物組進(jìn)行的孵化實(shí)驗(yàn)表明，胍可作為環(huán)境中硝化的底物。胍作為comammox生長底物的鑒定顯示了這些全球重要硝化菌的意想不到的利基，并為它們的分離提供了機(jī)會。這項(xiàng)研究不僅揭示了comammox微生物的新功能，也為理解微生物在氮循環(huán)中的作用提供了新的視角，并為未來的環(huán)境生物技術(shù)和生態(tài)研究開辟了新的道路。