研究簡(jiǎn)介:PGDH是一種關(guān)鍵的酶，負(fù)責(zé)控制子宮內(nèi)前列腺素的水平，而前列腺素在分娩的生理過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。硫化氫是一種內(nèi)源性的氣體信號(hào)分子，參與了許多生理和病理過(guò)程，但其在分娩過(guò)程中的確切作用尚不明確。確定了硫化氫生成酶，包括半胱氨酸β-合成酶（CBS）和半胱氨酸γ-裂解酶（CSE），在人類蛻膜中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)在分娩期間，無(wú)論是足月還是早產(chǎn)，這些酶的表達(dá)量都有所下降。此外研究還發(fā)現(xiàn)硫化氫的產(chǎn)生率在分娩期間也有所降低，并且CBS的表達(dá)水平與PGDH的表達(dá)呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步探究硫化氫對(duì)PGDH表達(dá)的影響，研究者們使用了硫化氫供體NaHS和硫化氫前體L-半胱氨酸來(lái)處理蛻膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，并觀察到PGDH的表達(dá)和活性隨之增加。研究揭示了miR-26b和miR-199a這兩種微小RNA在硫化氫上調(diào)PGDH表達(dá)中的作用，硫化氫能夠抑制這兩種微小RNA的表達(dá)，而這兩種微小RNA的模擬物能夠阻斷硫化氫對(duì)PGDH表達(dá)的上調(diào)作用。本研究提供了硫化氫在維持妊娠期間蛻膜中PGDH表達(dá)穩(wěn)定性中的關(guān)鍵作用的證據(jù)，并指出硫化氫生成酶表達(dá)的降低可能導(dǎo)致分娩期間子宮內(nèi)前列腺素水平的增加，這可能與早產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。

Unisense硫化氫微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

將約100mg的胎盤組織放入含有蛋白酶抑制劑(2mmol/L苯基甲基磺酰氟、1mmol/L正釩酸鈉和10μg/mL阿普丁)的磷酸鹽緩沖液中，置于冰上。將組織勻漿并在4℃下離心，然后收集上清液。使用微型硫化氫微呼吸電極(型號(hào)H2S-MRCh；Unisense，丹麥)和Unisense PA2000放大器測(cè)定硫化氫產(chǎn)生的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)。測(cè)量是在溫控微呼吸室(Unisense)中進(jìn)行的。傳感器信號(hào)穩(wěn)定后，加入L-半胱氨酸(1毫摩爾/升)和生成硫化氫的輔助因子吡哆醛-5’-磷酸(1mmol/L)。然后在每個(gè)痕量的最初最陡斜坡處測(cè)定硫化氫產(chǎn)生率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

硫化氫在妊娠期間維持蛻膜中PGDH表達(dá)穩(wěn)定性的關(guān)鍵作用。研究顯示在足月和早產(chǎn)期間，蛻膜中硫化氫生成酶CBS和CSE的表達(dá)量降低，與非分娩期相比，硫化氫的產(chǎn)生率也有所下降。這種下降與PGDH表達(dá)的降低有關(guān)，暗示硫化氫生成酶的活性可能對(duì)PGDH的水平有直接影響。硫化氫供體NaHS和硫化氫前體L-半胱氨酸能夠在培養(yǎng)的蛻膜滋養(yǎng)層細(xì)胞中劑量依賴性地增加PGDH的表達(dá)和活性。揭示了miR-26b和miR-199a在硫化氫調(diào)控PGDH表達(dá)中的潛在作用。硫化氫能夠抑制這兩種微小RNA的表達(dá)，而這兩種微小RNA的模擬物能夠阻斷硫化氫對(duì)PGDH表達(dá)的上調(diào)作用，表明它們可能參與了硫化氫對(duì)PGDH表達(dá)的調(diào)控。

圖1、γ-半胱氨酸合成酶(CSE)和β-半胱氨酸合成酶(CBS)在人胎膜中的定位。A和B：免疫組化分析顯示CSE(A)和CBS(B)陽(yáng)性染色的代表性切片。C和D：使用一抗得到的陰性對(duì)照切片被過(guò)量的相應(yīng)肽預(yù)吸收。箭頭表示陽(yáng)性染色。原始放大倍數(shù)，200(A-D)。AE：羊膜上皮；CT：絨毛滋養(yǎng)層；DC：蛻膜。

圖2、足月(TL)、非足月(TNL)和早產(chǎn)(PTL)絨毛組織中γ-半胱氨酸合成酶(CSE)和β-半胱氨酸合成酶(CBS)的表達(dá)、硫化氫產(chǎn)生率以及15-羥基前列腺素脫氫酶(PGDH)與CSE或CBS的相關(guān)性。絨毛組織取自TNL(24人)、TL(24人)或PTL(21人)時(shí)的單胎妊娠婦女。圖2A-C：TNL、TL和PTL絨毛膜組織中CSE(A)、CBS(B)和PGDH(C)的蛋白表達(dá)。有代表性的蛋白條帶顯示在相應(yīng)直方圖的頂部。D：絨毛組織勻漿中硫化氫產(chǎn)生的代表性痕跡。E：TNL、TL和PTL絨毛膜組織的硫化氫產(chǎn)生率。F和G：絨毛組織中PGDH與CSE或CBS的相關(guān)性。

圖3、硫化氫對(duì)培養(yǎng)的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中15-羥基前列腺素脫氫酶(PGDH)表達(dá)和活性的影響。A-C：NaHS對(duì)PGDH mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)以及活性(C)的影響。用濃度不斷增加的NaHS(10-5至10-4mol/L)處理細(xì)胞24小時(shí)。D-F：L-半胱氨酸對(duì)絨毛膜細(xì)胞中PGDH mRNA(D)、蛋白(E)和活性(F)表達(dá)的影響。用濃度不斷增加的L-半胱氨酸(10-4至10-3mol/L)處理細(xì)胞24小時(shí)。G-I：DL-丙炔基甘氨酸(PAG)和氨基氧乙酸半鹽酸鹽(AOAA)對(duì)L-半胱氨酸刺激PGDH mRNA(G)和蛋白(H)表達(dá)及活性(I)的影響。在PAG和AOAA存在或不存在的情況下，用L-半胱氨酸(10-3mol/L)處理細(xì)胞24小時(shí)。J-L：β-半胱氨酸合成酶(CBS)和γ-半胱氨酸合成酶(CSE)在L-半胱氨酸刺激PGDH表達(dá)中的作用。用CSE siRNA、CBS siRNA或干擾siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用10-3mol/L L-半胱氨酸處理24小時(shí)。轉(zhuǎn)染CSE siRNA(J)和CBS siRNA(K)的細(xì)胞中CBS和CSE的代表性表達(dá)。L-半胱氨酸對(duì)轉(zhuǎn)染CSE siRNA和CBS siRNA細(xì)胞中PGDH表達(dá)的影響(L)。PGDH mRNA和蛋白的表達(dá)及活性分別通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR、Western印跡分析和轉(zhuǎn)化檢測(cè)進(jìn)行測(cè)定。

圖4、miR-26b和miR-199a參與硫化氫對(duì)絨毛膜中15羥基前列腺素脫氫酶(PGDH)表達(dá)的調(diào)控以及miR-26b和miR-199a的表達(dá)。A和B：含有PGDH 3’-非翻譯區(qū)(UTR)及其3’-UTR突變核苷酸的報(bào)告基因的熒光素酶檢測(cè)。在沒有或有miR-26a、miR-26b和miR-199b模擬物的情況下，用上述報(bào)告物轉(zhuǎn)染絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞。使用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞裂解物中的熒光素酶活性。C：miR-26b和miR-199a抑制劑及模擬物對(duì)PGDH表達(dá)的影響。用miR-26b和miR-199a抑制劑及模擬物處理絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。D和E：硫化氫對(duì)miR-199a和miR-26b表達(dá)的影響。用L-半胱氨酸和NaHS處理細(xì)胞24小時(shí)。實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)miR-199a(D)和miR-26(E)的水平。F和G：miR-26b和miR-199a模擬物對(duì)硫化氫調(diào)控PGDH表達(dá)的影響。在沒有或有miR-26b(F)和miR-199a(G)模擬物的情況下，用L-半胱氨酸和NaHS處理細(xì)胞24小時(shí)。通過(guò)Western印跡分析測(cè)定PGDH蛋白表達(dá)。

結(jié)論與展望

絨毛膜NAD依賴性15-羥基前列腺素脫氫酶(PGDH)在控制子宮內(nèi)前列腺素的數(shù)量方面起著關(guān)鍵作用，并與分娩過(guò)程有關(guān)。之前的研究在胎膜中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生硫化氫的β-半胱氨酸合成酶(CBS)和γ-半胱氨酸合成酶(CSE)。本輪的研究人員研究了硫化氫是否參與了分娩過(guò)程中絨毛膜中PGDH表達(dá)的調(diào)節(jié)。絨毛組織取自早產(chǎn)、足月或未足月的孕婦。與未足月組相比，足月組和早產(chǎn)兒組的CSE和CBS水平以及硫化氫產(chǎn)生率均呈下調(diào)趨勢(shì)。CBS水平與絨毛膜中PGDH的表達(dá)相關(guān)。硫化氫供體NaHS和前體L-半胱氨酸劑量依賴性地刺激了培養(yǎng)的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中PGDH的表達(dá)和活性。CBS抑制劑和CBS siRNA可阻斷L-半胱氨酸的作用，而CSE抑制劑和CSE siRNA則不能。硫化氫處理抑制了絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-26b和miR199a的表達(dá)，miR-26b和miR-199a模擬物阻斷了硫化氫對(duì)PGDH表達(dá)的上調(diào)。研究結(jié)果表明，硫化氫在人類妊娠期間維持絨毛膜中PGDH的表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。硫化氫生成酶表達(dá)的減少導(dǎo)致了分娩時(shí)子宮中前列腺素含量的增加。本研究中Unisense微呼吸系統(tǒng)被用來(lái)實(shí)時(shí)測(cè)量蛻膜組織樣本中硫化氫的產(chǎn)生速率。幫助研究者能夠準(zhǔn)確地測(cè)定蛻膜組織中硫化氫的產(chǎn)生情況，并進(jìn)一步分析硫化氫生成酶在分娩過(guò)程中的作用，特別是在足月和早產(chǎn)期間對(duì)PGDH表達(dá)的影響。研究者們認(rèn)為硫化氫生成酶的表達(dá)降低可能是導(dǎo)致分娩期間子宮內(nèi)前列腺素水平增加的原因之一，這可能與早產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。因此，硫化氫生成酶的活性和其對(duì)PGDH表達(dá)的調(diào)控可能成為預(yù)防早產(chǎn)的潛在治療靶點(diǎn)。這項(xiàng)研究不僅為理解硫化氫在分娩過(guò)程中的作用提供了新的視角，而且為未來(lái)的妊娠相關(guān)疾病的治療提供了可能的新策略。