研究簡介:介紹了卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）的生物學特性及其在人類健康中的重要性，特別是它在引起呼吸道疾病方面的作用。文章強調了卡他莫拉菌從先前被認為是無害的上呼吸道共生菌，到現(xiàn)在被確認為能夠引起上下呼吸道疾病，包括在嬰幼兒中常見的急性中耳炎，以及在成人中可能導致慢性阻塞性肺?。–OPD）的感染性加重。本研究重點放在了卡他莫拉菌的生物膜生長模式，這是一種在黏膜表面與其他共生細菌共同存在的形態(tài)。在生物膜中，特定的基因表達會上調，包括與反硝化途徑相關的基因。反硝化是一種細菌在缺氧條件下利用氮氧化物作為電子受體進行代謝的過程。在卡他莫拉菌中，研究者發(fā)現(xiàn)了兩個關鍵的開放閱讀框（ORFs），aniA和norB，它們編碼的蛋白質分別參與亞硝酸鹽和一氧化氮的還原過程。nsrR基因編碼了一個轉錄調控因子，對aniA和norB基因的表達具有抑制作用。當nsrR基因被失活時，aniA和norB的表達增加，這與亞硝酸鹽對卡他莫拉菌生長的抑制有關。

研究還發(fā)現(xiàn)，nsrR基因的突變體在亞硝酸鹽存在下的生長受到抑制，但這種抑制可以通過aniA基因的突變或nsrR基因的互補來逆轉。增進了我們對卡他莫拉菌如何在宿主中生存和致病的理解，而且可能為開發(fā)新的治療策略提供了潛在的靶點。通過了解這些基因和它們在細菌適應和致病過程中的作用，我們可以更好地控制和預防由卡他莫拉菌引起的感染。

Unisense微電極分析系統(tǒng)的應用

Unisense微電極分析系統(tǒng)被用于定量測量卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）在不同條件下對氮氧化物的代謝活動。首先將卡他莫拉菌的野生型和突變型菌株在BHI肉湯中培養(yǎng)至OD600（光學密度在600納米處）達到2.0，然后洗滌并重新懸浮在新鮮的BHI肉湯中至OD600為1.0。為了研究亞硝酸鹽（NO2-）的代謝，向細胞懸浮液中添加最終濃度為5 mM的NaNO2。使用氧氣不敏感的、N2O特異性的探針（N2O-50-3112）連接到皮安表（PA2000），并通過模數(shù)轉換器（ADC 216）記錄數(shù)據(jù)。在添加NaNO2后，監(jiān)測細胞懸浮液中N2O的產生。收集不同時間點的N2O的濃度數(shù)據(jù)，以評估卡他莫拉菌對這些氮氧化物的代謝速率和途徑。

實驗結果

研究確定了NsrR是一個關鍵的轉錄調控因子，它在卡他莫拉菌中調控著一個截斷的反硝化途徑。NsrR通過抑制aniA和norB兩個基因的表達來調控亞硝酸鹽還原酶和一氧化氮還原酶的活性。在nsrR基因失活的情況下，aniA和norB基因的表達顯著上調，這表明NsrR對這些基因具有負調控作用。這種調控對卡他莫拉菌在不同環(huán)境條件下的生存和適應至關重要。nsrR基因的突變體在低水平的亞硝酸鹽存在下生長受到抑制，這種抑制可以通過aniA基因的突變或nsrR基因的互補來逆轉。這表明NsrR在調節(jié)卡他莫拉菌對亞硝酸鹽的敏感性方面發(fā)揮著重要作用。通過使用微電極技術和分子生物學方法，揭示了卡他莫拉菌能夠通過AniA和NorB蛋白分別還原亞硝酸鹽和一氧化氮，并且能夠將一氧化氮進一步還原為一氧化二氮?？ㄋ赡芾闷浣財嗟姆聪趸緩皆谘跸拗茥l件下更有效地呼吸，并保護自己免受宿主防御機制產生的一氧化氮的侵害。這項研究增進了我們對卡他莫拉菌如何在宿主中生存、適應并引起疾病的理解，為開發(fā)新的防治策略提供了可能的靶點。

圖1、參與截短脫氮途徑的卡他莫拉菌基因產物示意圖及相關突變體的構建。(A)卡他莫拉菌的截短脫氮途徑包括所示的前三個酶解步驟?？ㄋ@然缺乏將N2O還原為N2的能力(用括號表示)。(B至D)包含norB、nsrR和aniA基因的卡他莫拉菌染色體位點示意圖，(B)野生型O35E菌株、(C)O35E nsrR突變體和(D)O35E aniA突變體的側翼區(qū)域。箭頭表示用于PCR的不同引物的相對位置。

圖2通過qRTPCR測定卡他莫拉菌ETSU-9野生型和突變株在不同生長條件下aniA的表達。從野生型ETSU-9(wt)和ETSU-9 nsrR突變體(nsrR)細胞中分離出總RNA，這些細胞在含30μM Desferal(DF30)的肉湯和連續(xù)流生物膜系統(tǒng)(BF)中生長，在鐵限制條件下處于浮游狀態(tài)(PT)。qRTPCR如“材料與方法”中所述進行。

圖3、NsrR對野生型、突變型和互補突變型卡他莫拉菌AniA蛋白表達的影響。用多克隆AniA抗血清(A)或CopB特異性單克隆抗體10F3(B)作為一抗，對菌株的全細胞裂解液進行Western印跡分析。泳道1，野生型菌株O35E；泳道2，O35E nsrR突變體；泳道3，O35E aniA突變體；泳道4，O35E nsrR(pWW115)；泳道5，O35E nsrR(pWW150)；第6道，野生型ETSU-9；第7道，ETSU-9 nsrR突變體；第8道，ETSU-9 aniA突變體；第9道，ETSU-9 nsrR(pWW115)；第10道，ETSU-9 nsrR(pWW150)。推測的AniA單體和二聚體的位置用A組右側的箭頭表示。CopB外膜蛋白被用作載荷對照，其位置在B組右側用箭頭表示。分子質量標記物的位置在各圖的左側。

圖4、NO2-對卡他莫拉菌野生型、突變型和互補突變株生長的影響。野生型菌株O35E(A)、O35E aniA突變體(B)、O35E nsrR突變體(C)、O35E nsrR aniA突變體(D)、O35E nsrR(pWW115)(E)和O35E nsrR(pWW150)(F)的細胞在BHI培養(yǎng)基(黑正方形)或含5mM NaNO2的BHI培養(yǎng)基(黑三角形)中生長。大部分數(shù)據(jù)為三個獨立生長實驗的平均值；B組數(shù)據(jù)例外，為兩個獨立實驗的平均值。

圖5、確定受NsrR調控的卡他莫拉菌基因。(A)按照材料與方法中的描述，對從野生型菌株O35E、7169和ETSU-9以及這些菌株的nsrR突變體中分離的總RNA進行了DNA微陣列分析。圖中顯示了在所有三個nsrR突變體中持續(xù)上調至少兩倍(P<0.002)的基因數(shù)據(jù)。誤差條表示標準偏差。(B)qRT-PCR分析norB、aniA、MC ORF 683和MC ORF 1550在菌株O35E的nsrR突變體和野生型細胞中的相對表達水平。qRT-PCR測量的內源對照是MC ORF 1234的表達。最大和最小相對表達水平用誤差條表示。

結論與展望

卡他莫拉菌在生物膜中的生長導致兩個開放閱讀框(ORF)aniA和norB的明顯上調，這兩個開放閱讀框被預測為分別編碼亞硝酸鹽還原酶和一氧化氮還原酶。研究表明，位于aniA和norB之間的一個ORF被命名為nsrR，它編碼一個預測的轉錄調節(jié)因子。通過DNA微陣列分析和定量反轉錄酶PCR測定，nsrR失活導致三種不同的卡他莫拉菌菌株中aniA和norB的表達增加。在nsrR突變體中轉入野生型nsrR基因會導致AniA蛋白表達量減少。DNA微陣列分析表明，另外兩個ORFs(MC ORF 683和MC ORF 1550)在nsrR突變體中也持續(xù)上調。與野生型細胞相比，nsrR突變體細胞消耗亞硝酸鹽和一氧化氮的速度更快。然而，低濃度的亞硝酸鈉完全抑制了nsrR突變體的生長。在nsrR突變體中引入aniA突變后，亞硝酸鹽對生長的抑制作用明顯逆轉，而野生型nsrR基因的反式存在則完全逆轉了這種抑制作用。NsrR對aniA表達的調控對亞硝酸鹽敏感，而NsrR對norB的調控對一氧化氮敏感。本研究提供了對卡他莫拉菌反硝化途徑及其調控機制的深入見解，并揭示了這些機制在細菌致病性中的潛在作用。unisense微電極技術在本研究的應用對于理解卡他莫拉菌在生物膜狀態(tài)下的代謝途徑，以及NsrR調控蛋白如何影響這些代謝途徑至關重要。通過這些數(shù)據(jù)，研究人員能夠更深入地了解卡他莫拉菌如何在宿主中生存，以及它如何響應和利用環(huán)境中的氮化合物。這對于揭示細菌的致病機制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。