齲病是口腔常見的感染性疾病之一。牙菌斑生物膜的形成是齲病形成的首要因素，而變異鏈球菌則是牙菌斑中主要的致齲菌之一。變異鏈球菌等產(chǎn)酸細(xì)菌通過分解糖類產(chǎn)酸，降低菌斑局部pH使牙面脫礦，最終形成齲損。這些酸性代謝產(chǎn)物是造成牙齒脫礦最直接的原因。目前，檢測菌斑基質(zhì)中pH值主要采用pH染料、微電極等方法，但這些測量方法常為非原位測量的方法，易帶入其他混雜因素。

變異鏈球菌是牙菌斑生物膜中的重要成員，該菌能夠代謝糖類產(chǎn)酸，降低局部pH，抑制其余細(xì)菌（如血鏈球菌）的生長，在競爭中逐漸成為優(yōu)勢菌。同時變異鏈球菌具有耐酸性，可以在低pH的環(huán)境中正常生長，并且產(chǎn)生更多的酸，使環(huán)境始終處于低pH狀態(tài)。牙菌斑生物膜形成迅速且較難清除，其中的微生物代謝產(chǎn)生的乳酸等酸性物質(zhì)不易流出亦不易被唾液中和，故可造成牙菌斑底部附著牙面的局部長期低pH環(huán)境。齲病的發(fā)生就始于局部低pH環(huán)境造成的牙體脫礦。由此可見，相對于細(xì)菌本身而言，其產(chǎn)酸造成的菌斑附著表面的低pH環(huán)境才是齲病發(fā)生的直接因素。如何直觀準(zhǔn)確地反映菌斑pH顯得尤為重要。本實驗構(gòu)建的低pH感應(yīng)系統(tǒng)以致齲微生物——變異鏈球菌作為報告菌，可用于與齲相關(guān)的微生物及微生態(tài)研究，不帶入其他影響因素，使用范圍廣。

目前，生物膜pH的測量方法大致有以下幾種。1）接觸式電極測量法：將微電極插入待測部位進行探測。2）取樣檢測法：將待測部位菌斑收集起來，再通過pH計進行檢測。這兩種方法簡單、便宜、靈活，但具有測量時會擾亂待測部位生物膜，測試時間不連續(xù)，唾液緩沖作用影響大，非原位檢測等缺點。3）內(nèi)在電極測量法：將微電極事先置于未形成生物膜的物體表面（如義齒基托、培養(yǎng)皿底部等），然后置于患者口內(nèi)或接入細(xì)菌，即可通過無線電技術(shù)連續(xù)長期地檢測pH。這種方法不擾亂生物膜的形成且為原位檢測，但其價格昂貴、操作復(fù)雜。4）pH染料法：使用商品化的pH熒光染料對生物膜進行染色和檢測。此方法中pH染料染色的操作易受生物膜厚度和表面粗糙程度等因素的影響，造成實驗誤差?？傮w來說，生物膜pH的測量方法不盡如人意，研究者們渴望尋得一種方便、廉價、連續(xù)原位測量且誤差較小的測量方法。本實驗構(gòu)建的變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)，于生物膜原位檢測pH，檢測方法操作簡單，可最大程度還原生物膜局部的真實pH高低狀態(tài)，減少人為因素帶入的影響。

不同pH和處理時間變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)單位面積熒光強度統(tǒng)計圖

唾液鏈球菌尿素酶編碼基因ureⅠ的啟動子pureⅠ酸誘導(dǎo)性強，機制較清楚。CodY蛋白與RNA聚合酶競爭pureⅠ上的結(jié)合位點，而pH的高低則決定CodY蛋白與結(jié)合位點的結(jié)合與解離。本課題組發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌中的CodY蛋白與唾液鏈球菌中的CodY蛋白高度同源，且有研究者將該啟動子轉(zhuǎn)入格氏鏈球菌中并驗證了該啟動子在鏈球菌屬其他菌種中也可以正常發(fā)揮酸誘導(dǎo)特性。研究中展望了使用該啟動子連接一段報告基因以制作生物膜pH探針的應(yīng)用前景。GFP具有熒光穩(wěn)定，非種屬特異，不影響細(xì)胞正常生理功能，可用于活細(xì)胞直接觀測等特點，其編碼基因常被作為報告基因用于啟動子功能驗證，報告菌株構(gòu)建，蛋白質(zhì)定位以及分泌的檢測等，也曾被用于變異鏈球菌中研究gtfB基因的表達(dá)調(diào)控。故本實驗將啟動子pureⅠ與gfp基因連接轉(zhuǎn)入變異鏈球菌中，從而構(gòu)建受環(huán)境pH調(diào)節(jié)熒光強弱的變異鏈球菌低pH報告系統(tǒng)。該系統(tǒng)感受環(huán)境pH的受體位于核酸層面，調(diào)控精度高，從而提高了此系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。

本研究在變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)的驗證中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)14 h后的生物膜樣本已檢測出較弱熒光，但熒光強度明顯低于處理后。筆者認(rèn)為，造成此現(xiàn)象的原因可能是：1）由于變異鏈球菌代謝產(chǎn)酸，雖已使用50%BHI培養(yǎng)基降低營養(yǎng)，并于培養(yǎng)基中加入酸堿緩沖劑Pipes，但經(jīng)檢測培養(yǎng)14 h后培養(yǎng)基仍處于弱酸性；2）質(zhì)粒在變異鏈球菌中為多拷貝狀態(tài)，而變異鏈球菌基因組codY基因為單拷貝。變異鏈球菌產(chǎn)生的CodY蛋白不足以在接近中性pH的環(huán)境下將pureⅠ啟動子完全阻遏，故仍可有GFP的合成。本課題組后期實驗計劃將融合片段pureⅠ-gfp整合到變異鏈球菌基因組中，以期具有更精確靈敏的pH感應(yīng)作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)可在一定的范圍內(nèi)原位反映生物膜局部pH狀態(tài)，具有一定的應(yīng)用前景。同時，本研究驗證了唾液鏈球菌尿素酶基因的啟動子pureⅠ在變異鏈球菌中可以正常發(fā)揮酸誘導(dǎo)功能，為日后進一步將該啟動子應(yīng)用于變異鏈球菌基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)。