研究簡介:研究表明，絕經(jīng)前女性的心臟病發(fā)病率低于同齡男性，但這種性別優(yōu)勢在女性絕經(jīng)后消失，這提示內(nèi)源性雌激素可能具有心臟保護作用。雌激素已被證實具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其中抗氧化應(yīng)激是與心臟保護相關(guān)的關(guān)鍵效應(yīng)之一。雌激素能夠減少心肌中的活性氧種類生成，并通過抑制缺血/再氧合誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激來減少細(xì)胞凋亡。硫化氫（H2S）作為一種新發(fā)現(xiàn)的氣體信號分子，硫化氫在心肌中主要由CSE合成，并且已被證明具有心臟保護作用，其機制之一是抗氧化應(yīng)激。之前的研究表明，雌激素治療能夠改善氧化應(yīng)激，恢復(fù)因去卵巢手術(shù)導(dǎo)致的大鼠心肌中CSE表達(dá)和硫化氫生成的降低，提示雌激素可能通過維持心肌中CSE的表達(dá)來保護心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害。

本研究旨在證實CSE有助于17β-雌二醇(E2)對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的心臟保護作用，并闡明亞型雌激素受體在E2對CSE的調(diào)控中的作用。由于Sp-1與多種細(xì)胞中CSE的調(diào)控有關(guān)，而已知雌激素可調(diào)控心肌中的多種miRs，因此研究人員進一步確定Sp-1是否介導(dǎo)了雌激素對CSE的調(diào)控，并確定心肌中調(diào)控CSE的miRs。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

使用微型硫化氫微呼吸瓶(型號H2S-MRCh；Unisense)和Unisense PA2000放大器測量了原代培養(yǎng)的大鼠新生心肌細(xì)胞產(chǎn)生硫化氫的實時動力學(xué)。收集心肌細(xì)胞并在不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中清洗，培養(yǎng)基中用20mM HEPES代替碳酸氫鈉，以防止封閉的微呼吸瓶腔室(Unisense)中形成二氧化碳?xì)馀?。最終細(xì)胞團以1×107個細(xì)胞/毫升的濃度重懸，并將0.1毫升細(xì)胞懸液注入呼吸瓶。此外，為避免硫化氫自發(fā)氧化，在加入心肌細(xì)胞之前，用氮氣對呼吸室中的培養(yǎng)基進行脫氧。微電極信號穩(wěn)定后，加入L-半胱氨酸(1mmol/L，CSE的底物)和5-磷酸吡哆醛(1mmol/L，CSE的輔助因子)以刺激硫化氫生成。在添加底物和輔助因子后，在每個跡線的最初最陡斜坡處測定硫化氫生成率。細(xì)胞活力通過胰藍(lán)排除法進行評估，在整個實驗過程中，細(xì)胞活力保持在90%以上。每次實驗后，根據(jù)制造商的手冊，使用與實驗相同的緩沖液和條件，用新鮮制備的缺氧硫化鈉原液(0-100μmol/L)校準(zhǔn)硫化氫微電極。

實驗結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)雌激素17β-雌二醇（E2）通過與雌激素受體α（ERα）結(jié)合，在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和雌性小鼠體內(nèi)上調(diào)了CSE的表達(dá)。E2能夠降低心肌細(xì)胞中miR-22的表達(dá)。miR-22是一種微小RNA，能夠靶向ERα和Sp-1，調(diào)控它們的表達(dá)水平。E2通過降低miR-22的表達(dá)，間接促進了特異性蛋白-1（Sp-1）的表達(dá)。Sp-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到CSE基因啟動子區(qū)域的保守位點上，從而促進CSE基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。由于Sp-1的上調(diào)，CSE基因的表達(dá)得到了增強，導(dǎo)致心肌細(xì)胞中硫化氫的產(chǎn)生增加。硫化氫的增加有助于提高心肌細(xì)胞的抗氧化防御能力，從而保護心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。E2通過上述機制，增強了心肌細(xì)胞對H2O2和缺氧/再氧合（H/R）誘導(dǎo)的損傷的抵抗力，顯示出心臟保護作用。揭示了雌激素在性別差異心臟病發(fā)病率中可能發(fā)揮的分子機制，尤其是在絕經(jīng)前女性中觀察到的較低心臟病發(fā)病率。

圖1、CSE抑制劑減弱E2介導(dǎo)的原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激保護作用。在無CSE抑制劑(PAG，1mmol/L)或有CSE抑制劑存在的情況下，用E2(10nmol/L)培養(yǎng)細(xì)胞24小時。然后將細(xì)胞暴露于H2O2(200μmol/L)中4小時。通過MTT(A)和上清液LDH濃度(B)評估細(xì)胞的整體存活率。通過Western blot分析確定裂解的Caspase-3(C)和磷酸化的Akt(D)水平。

圖2、CSE siRNA可減弱E2-介導(dǎo)的原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激保護作用。用對照siRNA或CSE siRNA預(yù)處理細(xì)胞24小時，然后用或不用E2(10nmol/L)孵育24小時。A-D，然后將細(xì)胞暴露于H2O2(200μmol/L)4小時。E-H，然后將細(xì)胞放入?yún)捬跏遥?2%N2、5%CO2和3%O2凈化24小時，然后復(fù)氧2小時。通過MTT(圖A和E)和上清液LDH濃度(圖B和F)評估整體細(xì)胞活力。通過Western印跡法測定裂解的Caspase-3(圖C和圖G)和磷酸化的Akt(圖D和圖H)水平。

圖3、E2在原代培養(yǎng)的新生心肌細(xì)胞中介導(dǎo)E2對CSE表達(dá)的調(diào)節(jié)。A，用指定劑量的E2刺激細(xì)胞24小時。采用定量實時RT-PCR和Western印跡分析分別測定心肌細(xì)胞(n=4)中CSE mRNA和蛋白的表達(dá)。B，用E2(10nmol/L)刺激細(xì)胞24小時。實時硫化氫生成測量用于確定硫化氫生成率，如材料和方法中所述(n=3)。C，在無或有非特異性ER拮抗劑ICI 182780(1μmol/L)、ERα特異性拮抗劑MPP(1μmol/L)或ERβ特異性拮抗劑THC(1μmol/L)的情況下，用E2(10nmol/L)處理細(xì)胞24小時。定量實時RT-PCR和Western印跡分析分別用于測定心肌細(xì)胞(n=4)中CSE mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。D，用對照siRNA或ERαsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時，然后用E2(10nmol/L)處理24小時。采用實時RT-PCR定量分析和Western印跡分析分別測定心肌細(xì)胞中CSE mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)(n=4)。E，對雌性小鼠進行雙側(cè)卵巢切除術(shù)以清除內(nèi)源性雌激素。外源性E2和ERα選擇性激動劑(PPT)和ERβ選擇性激動劑(DPN)均持續(xù)給藥4周。采用Western印跡分析測定心肌中CSE蛋白的表達(dá)(每組8人)。

圖4、Sp-1在大鼠心肌細(xì)胞中介導(dǎo)E2對CSE的上調(diào)。A，蛋白合成抑制劑(CHX)對E2誘導(dǎo)的CSE mRNA表達(dá)的影響。用CHX(10μmol/L)預(yù)處理原代培養(yǎng)的新生心肌細(xì)胞1小時，然后用E2(10nmol/L)刺激24小時。通過實時RT-PCR定量評估CSE mRNA的穩(wěn)態(tài)水平。B、E2對Sp-1表達(dá)的影響。用指定劑量的E2處理原代培養(yǎng)的新生兒心肌細(xì)胞24小時。定量實時RT-PCR和Western印跡分析分別用于檢測Sp-1mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。C，ERα介導(dǎo)E2誘導(dǎo)的Sp-1表達(dá)。用對照siRNA或ERαsiRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的新生兒心肌細(xì)胞24小時，然后用E2(10nmol/L)處理24小時。D，Sp-1在E2上調(diào)CSE表達(dá)中的作用。用對照siRNA或Sp-1 siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的新生兒心肌細(xì)胞，然后用E2(10nmol/L)處理24小時。E，E2對大鼠CSE啟動子活性的影響。用大鼠CSE啟動子-熒光素酶報告構(gòu)建體pGL3-CSE或突變構(gòu)建體pGL3-CSE SP1轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，然后暴露于E2 24小時。使用雙熒光素酶報告實驗分析啟動子活性。實時定量RT-PCR和Western印跡分析分別用于測定CSE或Sp-1 mRNA表達(dá)和心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)(n=4)。

圖5、E2療法對卵巢切除大鼠心肌中miR22、ERα和Sp-1表達(dá)的影響。對雌性大鼠進行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，以消耗內(nèi)源性雌激素。外源性E2給藥8周。定量實時RT-PCR和Western印跡分析分別用于測定miR-22的表達(dá)(A)以及ERα和Sp-1的蛋白表達(dá)(B)。條形圖內(nèi)的圓圈表示每組的人數(shù)。所有條形圖均代表平均±SEM，代表性的Western印跡條帶位于相應(yīng)圖的頂部。D，用線性回歸法分析miR-22與Sp-1水平的相關(guān)性。E，線性回歸法分析ERα與Sp-1水平的相關(guān)性。

結(jié)論與展望

硫化氫主要通過胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)在心肌中產(chǎn)生，具有心臟保護作用。前期的研究表明，雌激素可以增強雌性大鼠心肌中CSE的表達(dá)。本研究旨在探討雌激素調(diào)節(jié)CSE表達(dá)的機制，特別是闡明雌激素受體亞型的作用以及負(fù)責(zé)雌激素作用的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)CSE抑制劑或CSE小干擾RNA減弱了17β-雌二醇(E2)對原代培養(yǎng)的新生兒心肌細(xì)胞中H2O2-和缺氧/復(fù)氧引起的損傷的保護作用。E2在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和體內(nèi)雌性小鼠的心肌中通過雌激素受體(ER)-α刺激CSE表達(dá)。在大鼠CSE啟動子中鑒定出特異性蛋白1(Sp-1)共有位點，并發(fā)現(xiàn)該位點介導(dǎo)E2誘導(dǎo)的CSE表達(dá)。E2增加卵巢切除大鼠心肌中ERα和Sp-1的表達(dá)并抑制microRNA(miR)-22的表達(dá)。在原代心肌細(xì)胞中，E2通過ERα介導(dǎo)的miR-22下調(diào)來刺激Sp-1表達(dá)。已證實ERα和Sp-1都是miR-22的靶標(biāo)。在卵巢切除大鼠的心肌中，miR-22的水平與CSE、ERα、Sp-1和抗氧化生物標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，與氧化生物標(biāo)志物呈正相關(guān)。使用Unisense微呼吸測量系統(tǒng)，研究人員能夠準(zhǔn)確地測量和分析硫化氫的產(chǎn)生，這對于理解雌激素對心臟的保護機制以及CSE在其中的作用至關(guān)重要?？傊狙芯勘砻?，雌激素通過ERα介導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-22下調(diào)來刺激Sp-1，導(dǎo)致CSE上調(diào)，進而導(dǎo)致抗氧化防御增強。ERα、miR-22和Sp-1的相互作用可能在雌性大鼠心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)的控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。