目的探索硫化氫對(duì)異丙腎上腺素所致豚鼠乳頭肌早后除極及觸發(fā)活動(dòng)的影響。方法應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)玻璃微電極技術(shù)記錄豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位,用異丙腎上腺素誘發(fā)早后除極和觸發(fā)活動(dòng),觀察硫化氫對(duì)早后除極和觸發(fā)活動(dòng)的影響。結(jié)果1)含異丙腎上腺素(50 nmol/L)的K-H液灌流可引起豚鼠右心室乳頭肌產(chǎn)生早后除極并出現(xiàn)觸發(fā)活動(dòng),有時(shí)觸發(fā)活動(dòng)會(huì)出現(xiàn)持久的節(jié)律性活動(dòng)。2)NaHS(100、200μmol/L)預(yù)處理可顯著降低異丙腎上腺素誘發(fā)的早后除極波幅及發(fā)生率和觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生率(**P<0.01),NaHS 200μmol/L還明顯延長(zhǎng)早后除極的潛伏期(*P<0.05)。結(jié)論硫化氫抑制異丙腎上腺素所致早后除極及觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生。


早后除極(early afterdepolarization,EAD)發(fā)生在動(dòng)作電位(action potential,AP)尚未結(jié)束前,是在AP復(fù)極2相或3相過(guò)程中出現(xiàn)的膜電位的瞬時(shí)性或振蕩性改變,常伴隨AP時(shí)程的延長(zhǎng)。當(dāng)EAD幅度>10mV時(shí),形成非驅(qū)性AP,稱為觸發(fā)活動(dòng)(Triggerd activity,TA)。許多臨床和實(shí)驗(yàn)室研究均表明EAD和TA在QT間期延長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用,導(dǎo)致長(zhǎng)QT間期綜合征,由此引起人們對(duì)EAD研究的高度重視。


硫化氫(H2S)作為繼一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化碳(CO)之后的第三種新型內(nèi)源性氣體信號(hào)分子,它不但可以在體內(nèi)內(nèi)源性的產(chǎn)生,并發(fā)揮重要的生理調(diào)節(jié)功能。研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)于整個(gè)心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)具有重要的作用。而目前H2S與疾病關(guān)系的研究較少,有關(guān)H2S在一些心血管疾病如心律失常方面作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用微電極技術(shù),研究硫化氫對(duì)異丙腎上腺素(Iso)所致豚鼠離體心室乳頭肌EAD及TA的影響,旨在為硫化氫的抗心律失常作用提供依據(jù)。


1、材料與方法


1.1主要試劑

硫氫化鈉(NaHS),購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。


1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康純色雄性豚鼠8只,體重300~400 g。


1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器

多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)RM6240BDJ型、微電極放大器SWF-2型、數(shù)字式超級(jí)恒溫浴槽HSS-1型、微電極拉制儀WD-1型均購(gòu)自成都儀器廠,微推進(jìn)器CZ-6型(上海儀表機(jī)械制造廠)、電子蠕動(dòng)泵DDB-300型(寧波石浦海天電子儀器廠)、酸度計(jì)SPM-10A型(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。


1.4營(yíng)養(yǎng)液成份

正常K-H液成分(mmol/L):NaCl 118.0,KCl 4.7,CaCl22.5,MgSO4·7H2O 1.6,KH2PO41.2,NaHCO325.0,葡萄糖11.1。


1.5方法

將豚鼠擊昏后迅速打開胸腔,取出心臟,置于95%O2、5%CO2氧飽和的0~4℃K-H液(pH值7.38±0.03)中,輕輕擠出積血,沿前室間溝右緣剪開右心室,選擇分支少、大小約0.6mm×1mm×3mm的柱狀乳頭肌,用線結(jié)扎腱索端剪下乳頭肌,用不銹鋼針固定于標(biāo)本槽底部的硅膠上。用35.5±0.5℃的K-H液恒溫恒速灌流乳頭肌,流速為4mL/min。將尖端電阻10~20MΩ、充灌KCl(3mol/L)的玻璃微電極尖端插入乳頭肌標(biāo)本,由刺激器提供波寬1ms,頻率2Hz,強(qiáng)度為1.5倍閾刺激的方波信號(hào)以場(chǎng)刺激驅(qū)動(dòng)標(biāo)本,生物電信號(hào)經(jīng)微電極放大器放大后,經(jīng)RM6240BDJ型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)輸入計(jì)算機(jī)。標(biāo)本在正常的K-H液中平衡1 h后,改用含Iso(50 nmol/L)的K-H液灌流,誘發(fā)EAD和TA,記錄EAD的潛伏期、幅值和發(fā)生率,TA的發(fā)生率。然后分別預(yù)先用含NaHS(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的K-H液灌流10min,隨后再加入含Iso(50 nmol/L)的K-H液灌流標(biāo)本,記錄EAD和TA各參數(shù),最后用KH液沖洗至AP恢復(fù)正常。


2、結(jié)果


2.1異丙腎上腺素誘發(fā)早后除極及觸發(fā)活動(dòng)特性


Iso 50 nmol/L使豚鼠乳頭肌AP的復(fù)極時(shí)間明顯延長(zhǎng),但不影響除極過(guò)程。在延長(zhǎng)復(fù)極時(shí)間的過(guò)程中,可誘發(fā)豚鼠乳頭肌出現(xiàn)EAD,并可發(fā)展為TA,甚至可見(jiàn)TA發(fā)展為持久的節(jié)律性活動(dòng),此外,有的還會(huì)伴有遲后除極的出現(xiàn)。


2.2硫化氫對(duì)Iso所致早后除極及觸發(fā)活動(dòng)的影響


NaHS 50μmol/L對(duì)Iso所誘發(fā)的豚鼠乳頭肌早后除極和觸發(fā)活動(dòng)無(wú)明顯影響,NaHS 100μmol/L可顯著降低EAD幅度及EAD和TA發(fā)生率,NaHS 200μmol/L還明顯延長(zhǎng)TA潛伏期。見(jiàn)表1。


表1 HS對(duì)Iso所致豚鼠乳頭狀肌EAD及TA的影響(±s)2

*P<0.05,**P<0.01。


組別n EAD TA發(fā)生率(%)潛伏期(min)幅值(mV)發(fā)生率(%)Iso(50 nmol/L)8 100 16±9 21±3 100 NaHS(50μmol/L)8 100 18±7 18±2 100+Iso(50 nmol/L)NaHS(100μmol/L)8 75**27±18**11±6 62**+Iso(50 nmol/L)NaHS(200μmol/L)8 50**37±18**4±3*38**+Iso(50 nmol/L)


3、討論


觸發(fā)活動(dòng)根據(jù)其時(shí)相特征分為早期后除極化(EAD)及延遲后除極化(delayed afterdepolarization,DAD)兩種類型。目前認(rèn)為凡能使動(dòng)作電位2、3時(shí)相正離子內(nèi)流增加或外流減少的因素均可延長(zhǎng)動(dòng)作電位和復(fù)極時(shí)程,從而引起EAD。Ca2+內(nèi)流,可使心肌細(xì)胞動(dòng)作電位平臺(tái)期延長(zhǎng),復(fù)極時(shí)間延長(zhǎng)而導(dǎo)致EAD的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載時(shí),肌漿網(wǎng)Ca2+釋放增多,進(jìn)一步引發(fā)EAD。異丙腎上腺素通過(guò)激活心肌細(xì)胞的β2受體,進(jìn)一步激活腺苷酸環(huán)化酶,進(jìn)而提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,最終激活cAMP依賴性蛋白激酶,而達(dá)到增加Ca2+內(nèi)流。細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載又將引起肌漿網(wǎng)Ca2+釋放增多,加重細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,進(jìn)一步促進(jìn)EAD的發(fā)生。


內(nèi)源性H2S是由L-半胱氨酸在磷酸吡哚醛-5'-磷酸依賴性酶,即胱硫醚-β-合成酶(cystathionie-βsythase,CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γlyase,CSE)、半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶等催化作用下產(chǎn)生的。在心血管系統(tǒng)內(nèi)源性H2S主要是通過(guò)CSE催化產(chǎn)生?,F(xiàn)有的研究報(bào)告表明H2S能夠濃度依賴性地縮短離體豚鼠乳頭肌的動(dòng)作電位時(shí)程,降低動(dòng)作電位幅值和超射值,減慢零相最大上升速度,其機(jī)制可能通過(guò)興奮KATP通道促進(jìn)K+外流,同時(shí)抑制Ca2+內(nèi)流,進(jìn)而影響豚鼠乳頭狀肌電生理效應(yīng)。到目前為止,H2S被確認(rèn)為第一個(gè)作用于血管平滑肌細(xì)胞KATP通道的氣體開放劑,在心肌細(xì)胞上也有KATP通道的廣泛分布。有文獻(xiàn)報(bào)道,H2S可借助KATP通道的開放,使鉀離子外流增加,從而造成心肌細(xì)胞膜的超極化;同時(shí),由于鉀離子外流,可抑制鈣離子內(nèi)流。激活KATP通道還可縮短動(dòng)作電位平臺(tái)期,使Ca2+內(nèi)流減少,從而減輕心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣超載。以上研究顯示,H2S可能通過(guò)開放KATP通道,抑制鈣離子內(nèi)流進(jìn)而抑制EAD和TA的產(chǎn)生,這為H2S的抗心律失常作用提供了重要依據(jù)。