研究簡介:細胞衰老加劇是導致衰老和多種疾病的主要原因之一。衰老的特點是持續(xù)的細胞周期停滯和各種細胞獨特的促炎分泌表型，這創(chuàng)造了衰老微環(huán)境（SME），在負反饋循環(huán)中驅(qū)動組織功能障礙惡化，從而降低自我修復能力組織。氫分子(H2)由于其抗氧化能力，可以選擇性清除羥基等高氧化性/毒性自由基，已被證明是一種新興的安全、有效和廣譜抗炎劑。由于衰老與氧化應激密切相關，H2被發(fā)現(xiàn)對許多細胞（骨髓間充質(zhì)干細胞成纖維細胞）和內(nèi)皮組織具有抗衰老作用，且無明顯毒副作用，表現(xiàn)出良好的抗衰老選擇性和普適性。然而，衰老/損傷疊加衰老比個體衰老或損傷引起的衰老嚴重得多，并且H2對衰老骨損傷引起的衰老/損傷并發(fā)衰老的影響目前尚不清楚。此外，此前報道的H2抗衰老給藥途徑主要是口服富氫水和吸入氫氣，無法長期達到高H2濃度。由于H2的溶解度低且分散度高，其在病變部位的持續(xù)時間較長，導致抗衰老功效有限。

本研究首先揭示了持續(xù)H2供應對于重塑老化骨中SME的必要性，然后設計了一種聚羥基脂肪酸酯（PHA）封裝的CaSi2納米粒子（CSN）負載介孔生物活性玻璃（MBG）支架（CSN PHA-MBG）用于局部持續(xù)（長達1周）釋放高劑量H 2（911 mL/g CSN），實現(xiàn)有效重塑SME并增強受損老化骨骼的修復。研究發(fā)現(xiàn)了SME重塑修復損傷老化骨的機制，持續(xù)的H 2治療普遍減輕了SME中的氧化應激，并通過抗炎途徑有效地重塑了各種衰老細胞的SASP，誘導巨噬細胞復極化至抗炎表型、骨髓間充質(zhì)干細胞募集、血管生成和成骨，支持受損的老化骨修復。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應用

通過氫氣電極（Unisense，丹麥）檢測CSN和CSN PHA-MBG在PBS緩沖液（pH 7.4）中的氫氣釋放行為，并根據(jù)預先建立的氫氣濃度計算氫氣濃度氫溶解水梯度濃度的氫校準曲線。

實驗結果

揭示了持續(xù)H2供應對于重塑老化骨中SME的必要性，然后設計了一種聚羥基脂肪酸酯（PHA）封裝的CaSi 2納米粒子（CSN）負載介孔生物活性玻璃（MBG）支架（CSN PHA-MBG）用于局部持續(xù)（長達1周）釋放高劑量H2（911 mL/g CSN），實現(xiàn)有效重塑SME并增強受損老化骨骼的修復。CSN的儲氫能力比水高4.6×104倍，CSN PHA的持續(xù)釋氫能力（約1周）遠高于富氫水（約30分鐘）。發(fā)現(xiàn)了SME重塑修復損傷老化骨的機制，持續(xù)的H2治療普遍減輕了SME中的氧化應激，并通過抗炎途徑有效地重塑了各種衰老細胞的SASP，誘導巨噬細胞復極化至抗炎表型、骨髓間充質(zhì)干細胞募集、血管生成和成骨，支持受損的老化骨修復。

圖1、可持續(xù)H2處理衰老骨中的各種衰老細胞的體外抗炎和抗衰老行為。(a)測試持續(xù)H2治療對從老化骨骼中收集的BMSC、巨噬細胞和骨細胞的影響的示意圖;（b）代表性衰老生物標志物的測量（ROS、HO-1、p16、p21、Ki67、BMSC、巨噬細胞和骨細胞中的γ-H2A.X、TAF、SA-β-gal、IL-6和IL-1β）在有或沒有H2的情況下持續(xù)培養(yǎng)7天;(c)說明細胞衰老特征以及H2對SME調(diào)節(jié)的抗衰老、抗炎和再生保護作用。

圖2、CSN和CSN PHA-MBG支架的結構和釋氫行為。CSN的代表性SEM(a)和元素映射(b)圖像、CSN和CaSi 2原材料的XRD圖譜(c)、CSN PHA的代表性SEM和元素映射圖像(d)、SEM圖像不同放大倍數(shù)的CSN PHA-MBG支架的H 2釋放曲線，以及CSN含量為1 mg·mL?1產(chǎn)率。所有實驗獨立重復3次，結果相似。

圖3、支架治療7天后老化骨缺損部位的SASP成分分析。(a)細胞因子陣列分析實驗設計的示意圖；(b)代表性小鼠細胞因子陣列圖像(c)相應的定量（n=2個生物學獨立樣本）(d)通過ELISA測量的細胞因子水平。

圖4、使用CSN PHA-MBG支架修復老化骨缺損的結果。（a）用鈣黃綠素（綠色）和茜素紅S(紅色)對骨形成進行連續(xù)熒光標記；（b）并對礦物質(zhì)沉積率進行相應的定量分析(n=8個生物學獨立樣本),(c)對新組織進行組織學檢查第14天和第28天指定治療后的老化骨缺損部位，(d)對照、PHA-MBG或CSN PHA-MBG治療后第28天的新組織代表性SRμCT圖像；(e)相應的BV/TV量化、(f)Tb.Th和(g)Tb.N（n=3個生物學獨立樣本）；(h)代表性免疫染色圖像以及(i)p16（紅色）、Vpp3（紅色）的相應量化數(shù)據(jù)）。(j)指定治療后第28天新組織中的Osterix（白色）和Emcn（綠色）表達（n=4個生物學獨立樣本,說明氫介導的損傷老化骨再生機制，其中局部和持續(xù)的H<b0>CSN PHA-MBG支架的釋放通過誘導有效的抗炎（巨噬細胞極化）和普遍的抗衰老來重塑SME，從而促進MSC的募集并保留其再生能力。

圖5、PBS中CSN PHA-MBG和CSN累積H2釋放量的定量。CSN PHA-MBG和CSN均含有等量的CSN(1mg mL-1)1).由于H2在PBS中的溶解度低，24 h內(nèi)快速從CSN中釋放出來，因此H2從溶液中溢出，導致H2的累積量有顯著差異。在CSN PHA-MBG和CSN之間釋放。

結論與展望

衰老微環(huán)境會導致持續(xù)炎癥和內(nèi)在再生能力喪失，是老年人有效組織修復的主要障礙。在這項工作中，研究人員發(fā)現(xiàn)局部H2供應可以通過骨骼成熟骨的各種衰老細胞的抗炎和抗衰老作用來重塑衰老微環(huán)境。研究人員構建了一種H 2釋放支架，通過電噴霧聚羥基脂肪酸酯封裝的CaSi 2，將納米顆粒附著到介孔生物活性玻璃上可以釋放高劑量的H2（911 mL/g，長達1周）。在老年小鼠模型中展示了微環(huán)境的有效重塑和臨界尺寸骨缺損的增強修復。從機制上講，本研究揭示了局部H2釋放通過衰老巨噬細胞復極化和分泌組變化將微環(huán)境從促炎癥改變?yōu)榭寡装Y。相關研究結果還表明，H2可以減輕衰老/損傷疊加衰老的進展，促進內(nèi)源細胞的募集并保留其再生能力，從而創(chuàng)造一個能夠支持骨缺損再生的促再生微環(huán)境。研究關于局部H2釋放策略為骨再生提供了一種有前景的抗衰老方法。