目的:研究一氧化氮(NO)對(duì)豚鼠左心室流出道自發(fā)電活動(dòng)的影響及其對(duì)缺血/再灌注(I/R)時(shí)自發(fā)電活動(dòng)改變的影響。方法:采用標(biāo)準(zhǔn)玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)電位記錄技術(shù)觀測(cè)外源性NO供體硝普鈉(SNP)對(duì)豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應(yīng)電位的影響及其對(duì)I/R時(shí)該電位改變的影響。結(jié)果:1、10、100μmol/L SNP呈濃度依賴性地導(dǎo)致4相自動(dòng)除極速度(VDD)和自發(fā)放電頻率(RPF)明顯增加，但1 000μmol/L SNP的效應(yīng)不明顯。SNP呈濃度依賴性地導(dǎo)致最大舒張電位(MDP)絕對(duì)值和動(dòng)作電位幅度(APA)增大，0相最大除極速度(V(max))加快，復(fù)極50%和90%時(shí)間(APD(50)和APD(90))縮短。缺血10 min組VDD和RPF明顯減慢，APA和V(max)明顯增大，APD(50)和APD(90)明顯延長(zhǎng)。與缺血10 min組相比，再灌注10 min組VDD和RPF明顯加快，且常出現(xiàn)節(jié)律不齊，MDP絕對(duì)值和APA明顯減小，APD(50)和APD(90)明顯縮短。1、10、100μmol/L SNP再灌注時(shí)可明顯改善缺血造成的VDD和RPF減慢以及再灌注造成的節(jié)律不齊，1 000μmol/L SNP的上述效應(yīng)不明顯。各濃度SNP再灌注時(shí)均可使缺血造成的APA和APD的改變恢復(fù)至對(duì)照組水平。結(jié)論:SNP可呈濃度依賴性地增加左心室流出道的自律性，并可明顯改善I/R導(dǎo)致的自發(fā)慢反應(yīng)電位的改變。

哺乳類的心室流出道在發(fā)生上由動(dòng)脈球(心球)演化而來(lái)，在魚及兩棲類動(dòng)脈球是位于心室之后的一個(gè)獨(dú)立興奮和收縮單位，在人胚早期仍有動(dòng)脈球階段。課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，在豚鼠、大鼠及兔流出道的特定部位存在慢反應(yīng)自律細(xì)胞，并和動(dòng)脈球一樣具有自動(dòng)興奮的能力。缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)?？蓪?dǎo)致心律失常，其中90%的特發(fā)性室性心動(dòng)過(guò)速(idiopathic ventricular tachyarrhythmia，IVT)起源于右心室流出道，說(shuō)明心室流出道部位自律細(xì)胞的電生理特性可能與源于流出道心律失常的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。心臟I/R時(shí)，一氧化氮(nitric oxide，NO)合成的恢復(fù)或給予外源性NO很可能拮抗I/R誘導(dǎo)的損傷。為探討NO對(duì)I/R時(shí)心室流出道電生理特性的影響，本研究應(yīng)用玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)電位記錄技術(shù)，采用停灌/復(fù)灌方法模擬I/R，記錄并分析外源性NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)對(duì)I/R離體左心室流出道標(biāo)本自發(fā)慢反應(yīng)電位的影響。

材料和方法

1標(biāo)本制備

健康豚鼠，250～350 g，急性處死后迅速開胸取出心臟，并用O2飽和的改良Locke液(mmol/L;NaCl 157，KCl 5.6，CaCl22.1，NaHCO31.8，葡萄糖5.6，pH 7.3～7.4)經(jīng)冠脈進(jìn)行灌注沖洗，左心室流出道標(biāo)本制備參見文獻(xiàn)。制好的標(biāo)本用不銹鋼針固定于灌流槽(1.5 cm×2 cm)內(nèi)的硅橡膠上。用Ο2飽和的改良Locke液進(jìn)行恒溫(35℃±1℃)、恒速(10 mL/min)灌流，標(biāo)本在灌流液中穩(wěn)定30 min后開始實(shí)驗(yàn)。

2電位引導(dǎo)

采用常規(guī)玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)電位記錄技術(shù)，引導(dǎo)左心室流出道部位的自發(fā)慢反應(yīng)電位。如能直接記錄到自發(fā)電位，則不再進(jìn)行刺激，若記錄不到，則將刺激電極置于標(biāo)本遠(yuǎn)離瓣膜一端的心肌組織上，給予波寬2 ms、1 Hz、2倍閾強(qiáng)度的方波刺激，刺激時(shí)間由數(shù)秒至數(shù)分鐘不等，直至誘發(fā)出穩(wěn)定的自發(fā)節(jié)律，即停止電刺激開始實(shí)驗(yàn)。引導(dǎo)出的自發(fā)慢反應(yīng)電位，經(jīng)SWF-1B型高阻抗微電極放大器放大，一路輸入監(jiān)聽器監(jiān)聽，另一路采用RM6280多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，自動(dòng)顯示電信號(hào)，并分析自發(fā)慢反應(yīng)電位的各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)。

3觀測(cè)指標(biāo)

4相自動(dòng)除極速度(velocity of diastolic depolarization，VDD)、自發(fā)放電頻率(rate of pacemaker firing，RPF)、最大舒張電位(maximal diastolic potential，MDP)、0相最大除極速度(maximal rate of depolarization，Vmax)、動(dòng)作電位幅度(amplitude of action potential，APA)、復(fù)極50%時(shí)間(50%of duration of action potential，APD50)和APD90。

4實(shí)驗(yàn)過(guò)程和分組

待自發(fā)節(jié)律穩(wěn)定30 min后，開始采集一組正常的自發(fā)慢反應(yīng)電位作對(duì)照，然后采用一定濃度的藥液進(jìn)行灌流，實(shí)時(shí)記錄并分析各種因素對(duì)豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應(yīng)電位的影響。為保證藥效，各種藥液均在實(shí)驗(yàn)前1 h內(nèi)配制。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)SNP對(duì)豚鼠左心室流出道自律性電活動(dòng)的影響研究:SNP分為4個(gè)濃度組:1、10、100、1 000μmol/L SNP組，每個(gè)濃度組灌流10 min;(2)SNP對(duì)I/R豚鼠左心室流出道自律性電活動(dòng)改變的影響研究:采集對(duì)照自發(fā)慢反應(yīng)電位，停灌10 min待電位出現(xiàn)明顯改變后，再分別以含有1、10、100、1 000μmol/L SNP的灌流液再灌10 min，分別記錄對(duì)照組、停灌10 min組(I 10 min)和不同濃度SNP再灌10 min組(SNP+R 10 min)自發(fā)慢反應(yīng)電位的改變;(3)I/R時(shí)豚鼠左心室流出道自律性電活動(dòng)的改變研究:采集對(duì)照自發(fā)慢反應(yīng)電位，停灌10 min模擬缺血，然后以正常灌流液再灌，分別記錄對(duì)照組、停灌10 min組(I 10 min)、再灌10 min組(R 10min)自發(fā)慢反應(yīng)電位的改變，作為SNP對(duì)I/R電生理效應(yīng)的對(duì)照。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，給藥前后各項(xiàng)指標(biāo)采用自身配對(duì)t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 SNP對(duì)豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應(yīng)電位的影響

SNP可呈濃度依賴性導(dǎo)致左心室流出道自發(fā)慢反應(yīng)電位VDD和RPF逐漸加快，100μmol/L SNP組達(dá)最大效應(yīng)，1 000μmol/L SNP組VDD和RPF的加快效應(yīng)不明顯。各個(gè)濃度SNP灌流過(guò)程中，自發(fā)節(jié)律平穩(wěn)規(guī)整。沖洗10 min，自發(fā)節(jié)律恢復(fù)至給藥前水平，見圖1、2。

圖1 SNP對(duì)豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應(yīng)電位的影響

1、10和100μmol/L SNP灌流10 min，RPF與對(duì)照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，1 000μmol/L SNP組RPF相對(duì)于對(duì)照組無(wú)明顯加快。與10μmol/L SNP組相比，100μmol/L SNP組RPF明顯加快(P＜0.05)。

10和100μmol/L SNP灌流10 min，VDD與對(duì)照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，但1μmol/L SNP組VDD與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變。1 000μmol/L SNP組VDD與對(duì)照組相比無(wú)明顯加快，與100μmol/L SNP組相比反而明顯減慢(P＜0.05)。

與對(duì)照組相比，MDP絕對(duì)值呈濃度依賴性增大，1～1000μmo/L SNP均可使VPA增大，Vmax呈濃度依賴性加快，以1 000μmol/L SNP效應(yīng)最明顯，100和1 000μmol/L SNP組APD50和APD90顯著縮短，其中APD90的縮短更明顯(P＜0.01)，見圖1、2。

2 SNP對(duì)I/R過(guò)程中左心室流出道自發(fā)慢反應(yīng)電位改變的影響

2.1SNP對(duì)I/R過(guò)程中VDD和RPF改變的影響與對(duì)照組相比，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組缺血10 min組VDD和RPF均顯著減慢(P＜0.05)。缺血10 min后SNP再灌，與缺血10 min組相比，10和100μmol/L SNP+R組VDD明顯加快(P＜0.05)，1、10和100μmol/L SNP+R組RPF明顯加快(P＜0.05)，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，VDD和RPF逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平。1 000μmol/L SNP+R組對(duì)缺血10 min組的VDD和RPF減慢無(wú)明顯影響。SNP改善缺血10 min引起的VDD和RPF改變也呈現(xiàn)濃度依賴性，以100μmol/L SNP+R組效應(yīng)最明顯，1 000μmol/L SNP+R組反而相對(duì)較弱，見圖3、4。

缺血10 min后正常灌流液再灌，再灌注2 min組VDD和RPF明顯加快，與對(duì)照組和缺血10 min組相比均有顯著差異，且再灌注至5 min的過(guò)程中，自發(fā)節(jié)律不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)節(jié)律不齊，有二聯(lián)律、三聯(lián)律的出現(xiàn)。再灌注10 min組VDD和RPF明顯減慢(P＜0.05)，RPF恢復(fù)至接近對(duì)照組水平，VDD與對(duì)照組相比仍明顯加快(P＜0.05)。各個(gè)濃度SNP+R過(guò)程中，很少出現(xiàn)節(jié)律不齊，自發(fā)節(jié)律平穩(wěn)規(guī)整(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.2SNP對(duì)I/R過(guò)程中MDP、Vmax和APA改變的影響與對(duì)照組相比，缺血10 min組MDP絕對(duì)值和APA均有所增大，Vmax加快，部分表現(xiàn)為差異顯著(P＜0.05)。與缺血10 min組相比，正常灌流液再灌注10 min組MDP絕對(duì)值和APA明顯減小(P＜0.05)，Vmax明顯減慢(P＜0.05)，MDP絕對(duì)值和APA恢復(fù)至對(duì)照組水平。

與缺血10 min組相比，1μmol/L SNP+R組和100μmol/L SNP+R組MDP絕對(duì)值明顯減小(P＜0.05)，1和1 000μmol/L SNP+R組APA明顯減小(P＜0.05)，而100μmol/L SNP+R組APA反而明顯增大(P＜0.05)，Vmax變化不明顯，見圖3、4。

圖2 SNP對(duì)豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應(yīng)電位各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)的影響

圖3 SNP對(duì)I/R豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應(yīng)電位的影響

圖4 SNP對(duì)I/R豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應(yīng)電位各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)的影響

2.3SNP對(duì)I/R過(guò)程中APD50和APD90改變的影響

與對(duì)照組相比，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組缺血10 min組APD50明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)。與缺血10 min組相比，正常灌流液、再灌注10 min組以及1、10和100μmol/L SNP+R組APD50均顯著縮短(P＜0.05)，恢復(fù)至對(duì)照組水平。1 000μmol/L SNP+R組APD50恢復(fù)不明顯，見圖4。

與對(duì)照組相比，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組缺血10 min組APD90明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)。與缺血10 min組相比，各個(gè)濃度SNP+R組APD90均顯著縮短(P＜0.05)。與缺血10 min組相比，正常灌流液再灌注10 min組APD90也顯著縮短(P＜0.01)，見圖4。