研究簡介:糖尿病、血壓疾病、超重的發(fā)病率不斷上升以及人口壽命的延長是慢性傷口（尤其是下肢傷口）逐年增加的部分原因。迄今為止，醫(yī)生使用的最可靠的治療方法之一是銳性清創(chuàng)和去除死亡和感染的組織。然而，由于清創(chuàng)術(shù)很少能清除所有微生物，因此任何殘留的細菌都可能重新繁殖傷口。為了開發(fā)新的傷口護理療法，良好的體外模型是必要的。模型越真實，從實驗室規(guī)模的體外模型獲得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為體內(nèi)條件并且治療在實踐中取得成功的可能性就越大。本研究中的修改模型基于Chen等人最近發(fā)表的分層慢性傷口生物膜模型(CWB)，其中包含金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。首先基質(zhì)材料從瓊脂變?yōu)槟z原，從而從植物來源變?yōu)椴溉閯游?、人類相關(guān)材料。研究人員假設(shè)改變基質(zhì)可能會影響抗菌素耐受性。其次模型是在Transwell插入物中鑄造的。這允許在不引入剪切流的情況下從底部交換營養(yǎng)物和廢物。據(jù)推測，這將使模型能夠在更長的時間內(nèi)維持生長，并在細菌數(shù)量和物種間比率方面保持穩(wěn)定狀態(tài)。第三將原始模型中的生理鹽水替換為磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。研究人員通過制作這種新的、改良的體外模型的動機是創(chuàng)建一個類似傷口的微環(huán)境，在這種微環(huán)境中可以在類似體內(nèi)的條件下測試新穎的局部產(chǎn)品。通過培養(yǎng)與傷口相關(guān)的病原體，同時模擬多種環(huán)境因素，例如pH值、氧氣和溫度水平以及營養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)供應(yīng)，因為這些因素對潛在的治療有很大影響。該模型使用易于采購的材料在經(jīng)濟上可行，并且易于復(fù)制，從而為新傷口治療的半高通量篩選提供機會。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

使用unisense電化學(xué)微傳感器進行氧氣和pH值測量。pH微電極和參比電極的傳感器尖端直徑均為100μm（PH-100,Unisense A/S），氧氣微電極的傳感器尖端直徑為25μm（OX-25，Unisense A/S，)。傳感器連接至微傳感器萬用表(Unisense A/S)，并由運行Sensortrace Suite軟件(Unisense A/S)的PC控制。微傳感器尖端位于模型空隙的中間，并以100μm的垂直增量記錄信號，直到1100μm的深度。測量過程中，模型被放置在恒溫加熱塊上，保持在33°C。

實驗結(jié)果

提出了現(xiàn)有體外模型的修改版本，該模型滿足“理想”體外感染慢性傷口模型的八項擬議標準。它包含WSM，它基于提供半固體環(huán)境的膠原蛋白基質(zhì)，連續(xù)添加營養(yǎng)物質(zhì)而不在模型內(nèi)產(chǎn)生剪切流，它表達了幾種類型的3D梯度，并且它的表面不包含非哺乳動物成分或固體表面。生物膜可以生長。建立的模型在6天內(nèi)保持了金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的穩(wěn)定比例。此外，它表現(xiàn)出pH值≥8.0的堿性條件和陡峭的氧氣梯度，導(dǎo)致缺氧微環(huán)境，這與慢性傷口中觀察到的條件相似。因此，它提供了一個支架，可以在類似體內(nèi)的條件下測試局部傷口治療。測試的三種局部水凝膠均顯示CFU數(shù)量顯著減少。此外，它們降低了pH值，導(dǎo)致酸性條件，并減少了細菌耗氧量，這都是局部傷口愈合產(chǎn)品所需的品質(zhì)。僅通過評估存活的病原體來衡量新抗菌治療的效果是很常見。

圖1、改良的分層慢性傷口生物膜模型示意圖。

圖2、未經(jīng)處理模型隨時間變化的pH值和氧通量率。圖A中顯示了所有pH深度剖面(n=9)的單個值、平均值和標準偏差。圖B中顯示了氧氣通量速率(n=9)的單個值、平均值和標準偏差。pH值的變化使用Kruskal-Wallis檢驗和Dunn多重比較進行測試，包括Dunn校正，以觀察每個模型的pH值隨時間的顯著變化。將第0天的數(shù)據(jù)與第2、4和6天的數(shù)據(jù)進行比較。對于O2通量，使用雙尾Mann–Whitney U檢驗進行非參數(shù)分析，進行配對比較以確定兩個模型之間的顯著差異。

圖3、CWB模型中隨時間變化的pH值和氧氣梯度。顯示平均值和標準偏差（每個條件和每個時間點n=9）。在第0天，測量新鑄造的未經(jīng)處理的模型作為基線。第2天，觀察細菌對未處理模型的pH值和氧氣的影響。在第4天和第6天，獲得了處理對pH值和氧氣梯度的影響以及未處理模型的梯度。

圖4、mCWB模型中隨時間變化的pH值和氧氣梯度。顯示平均值和標準偏差（每個條件和每個時間點n=9）。在第0天，測量新鑄造的未經(jīng)處理的模型作為基線。第2天，觀察細菌對未處理模型的pH值和氧氣的影響。在第4天和第6天，獲得了處理對pH值和氧氣梯度的影響以及未處理模型的梯度。

圖5、第2天(A)、第4天(C)和第6天(E)的mCWB概述。所有天均觀察到金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的小菌落：第2天（B）、第4天（D）和第6天（F）。金黃色葡萄球菌=綠色，銅綠假單胞菌=紅色，死細菌=藍色。

結(jié)論與展望

本論文研究了一種新的體外慢性傷口生物膜模型，該模型提供了模擬哺乳動物組織成分的分層支架，可以在其上測試局部傷口護理產(chǎn)品。研究人員進一步更新了模型，以模擬營養(yǎng)物質(zhì)從下方的動態(tài)流入，就像慢性傷口的情況一樣。改良的體外模型是使用膠原蛋白代替瓊脂作為主要基質(zhì)成分創(chuàng)建的，并且包含金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。該模型被鑄造在Transwell插入物中，然后放置在傷口模擬介質(zhì)中，從而允許營養(yǎng)物質(zhì)和廢物通過過濾器進行交換。使用三種潛在的傷口護理產(chǎn)品和作為陽性對照的二葡萄糖酸氯己定2%溶液來評估模型。測試的產(chǎn)品由攜帶不同活性化合物的完全生物降解淀粉微球制成的水凝膠組成。將化合物局部涂抹并放置2-4天。使用unisense微電極剖面分析系統(tǒng)測量氧氣濃度和pH值，以評估處理對細菌活性的影響。獲得模型的共焦顯微鏡圖像以可視化微菌落的存在。研究結(jié)果表明，改良的體外模型在6天內(nèi)保持了兩種細菌種類的穩(wěn)定數(shù)量。在未經(jīng)處理的模型中，形成陡峭的氧氣梯度并且pH值增加至>8.0。含有活性化合物的水凝膠可緩解高耗氧量并大幅降低pH值。此外，與氯己定對照處理相比，所有三種水凝膠均顯著且更大程度地減少了集落形成單位。修改后的模型表現(xiàn)出與體內(nèi)慢性傷口相似的幾個特征。