研究簡介:在膜生物膜生物反應(yīng)器(MBfRs)中進行的好氧甲烷氧化-反硝化(AME-D)為同時減少甲烷(CH4)排放和去除廢水中的硝酸鹽提供了良好的前景。然而關(guān)于氧分壓如何影響反擴散生物膜的發(fā)育和特性、其空間分層特征以及生物膜微生物之間的協(xié)同作用等方面的系統(tǒng)實驗研究尚缺乏。在本研究中，研究人員首次將光學(xué)相干層析成像(OCT)與共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)相結(jié)合，原位表征了MBfR中反擴散生物膜的發(fā)展。結(jié)果表明，MBfR上的氧分壓能夠控制生物膜的厚度和空間分層，進而控制功能微生物的分布。在優(yōu)化的氧氣分壓5.5 psig(含氧量25%)條件下，AME-D工藝反擴散生物膜的反硝化效率最高，主要原因是該生物膜在好氧層和缺氧層之間具有良好的動態(tài)平衡，好氧層中有合適的氧氣梯度和足夠的好氧甲烷養(yǎng)菌，有利于甲烷氧化。

保留完全消耗的O2和可獲得的有機源，避免限制缺氧層的反硝化活性。通過宏基因組分析和熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)染色，成功證實了反擴散生物膜內(nèi)功能微生物的空間分布，發(fā)現(xiàn)典型的好氧反硝化菌Rhodocyclaceae在好氧層中存活并逐漸富集，在好氧反硝化過程中起著關(guān)鍵作用。該原位生物膜可視化和表征首次直接證明了AME-D在反擴散生物膜中的協(xié)同反硝化路徑，包括好氧甲烷營養(yǎng)菌、異養(yǎng)好氧反硝化菌和異養(yǎng)缺氧反硝化菌。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

通過使用微電極傳感器（OX-10，Unisense，丹麥）原位測量沿著生物膜深度的DO濃度梯度，該傳感器與皮安計連接用于數(shù)據(jù)采集。在如前所述測量DO分布之前，用無氧和飽和水校準(zhǔn)尖端直徑為10μm的微傳感器，將微電極安裝在馬達驅(qū)動的微操縱器上，使用Sensor Trace Pro軟件精確控制該微操縱器，電機驅(qū)動微傳感器沿生物膜厚度方向以5μm的深度步進從膜表面向本體液推進，控制微傳感器15 s達到穩(wěn)態(tài)，獲得溶解氧濃度分布的深度剖面，然后測量15 s，在每個位置收集5個重復(fù)樣品，再向前移動到下一個位置。利用解剖顯微鏡進行可視化觀察，以估計微傳感器與生物膜的相對位置，并選擇每個生物膜的頂部、中部和底部3個位置進行測量，以確保數(shù)據(jù)的重復(fù)性。

實驗結(jié)果

在反擴散生物膜AME-D工藝中，膜腔內(nèi)的氧分壓通過操縱生物膜發(fā)育過程和空間特性對反硝化性能產(chǎn)生顯著影響。CLSM和OCT觀察結(jié)果表明，當(dāng)氧分壓從1.1 psig增加到5.5 psig時，生物膜的定殖和積累速度加快，成熟時間相對較長后形成較厚的生物膜。當(dāng)進一步增加到6.6 psig時，過量的供氧會導(dǎo)致形成的生物膜呈顆粒狀團聚。微電極測量和FISH圖像分析表明，在氧分壓為5.5psig時，反擴散生物膜的反硝化性能最好，這主要是由于好氧層和缺氧層之間的動態(tài)平衡達到最佳，此時氧分壓為5.5psig，有利于反硝化菌的脫氮。紅環(huán)菌科傾向于生活在好氧層，在好氧反硝化過程中起主要作用，為AME-D過程由好氧甲烷營養(yǎng)菌、異養(yǎng)好氧反硝化菌和異養(yǎng)缺氧反硝化菌共同進行的新型協(xié)同機制提供了證據(jù)。

圖1、通過結(jié)合OCT和CLSM觀察，在不同氧分壓下生物膜時間發(fā)展的顯微可視化。（a）、（c）、（e）和（g）分別基于堆疊CLSM圖像的階段I至IV的微生物覆蓋因子;（B）、（d）、（f）和（h）相應(yīng)階段的生物膜厚度，基于原地OCT觀察。

圖2、不同氧分壓下生物膜微生物組成的變化：基于16s rRNA基因高通量測序的關(guān)鍵微生物群落在科水平上的相對豐度。

圖3、不同氧分壓下MBfRs中生物膜EPS含量的變化。

圖4、在MBfRs運行期間在不同氧分壓下的反硝化性能。（a）-MBfR出水中NO3?-N的濃度;（B）表面NO3?-的變化根據(jù)方程式S1計算的氮去除通量;（c）在每個階段結(jié)束時MBfR中的DO濃度;（d）每一階段結(jié)束時所有MBfR的TOC濃度。

圖5、(a)利用微電極監(jiān)測不同氧分壓下MBfR生物膜內(nèi)平均溶解氧分布的深度剖面圖，0μm處的點代表生物膜底部，誤差線表示多次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（n個（B）氧分壓對好氧/缺氧層生物膜分層的影響;（c）三重疊加FISH圖像，顯示反擴散生物膜中I型和II型好氧甲烷氧化菌和反硝化菌的空間分布。生物膜樣品通過Cy3標(biāo)記（Mγ84和Mγ705的混合物，紅色）對I型好氧甲烷氧化菌染色，通過FAM標(biāo)記（Mγ450，綠色）對II型好氧甲烷氧化菌染色，反硝化菌用Cy 5-標(biāo)記（DEN 67和TBD 1419的混合物，藍色），紫色表示I型甲烷氧化菌和反硝化菌的重疊，藍色表示II型甲烷氧化菌和反硝化菌的重疊。

結(jié)論與展望

本研究揭示了不同氧分壓下AME-D工藝中生物膜的動態(tài)發(fā)展特征，探討生物協(xié)同反硝化機理，在實驗室規(guī)模的6個不同氧分壓下平行運行MBfR，比較了不同氧分壓下MBfR的生物膜發(fā)育和反硝化性能.通過結(jié)合共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和光學(xué)相干性，在原位目視評價生物膜形態(tài)特征的動態(tài)差異體層攝影(OCT)，然后生物膜的組成包括胞外聚合物（EPS）和16 SrRNA分析其次利用微電極和熒光技術(shù)研究了生物膜空間分層對氧分壓的響應(yīng)。最后通過宏基因組分析，揭示了AME-D工藝中甲烷氧化和反硝化的協(xié)同作用，為反擴散MBfR的生物膜管理和分層提供了直觀的證據(jù)，而且鑒定了AME-D工藝中的實際微生物，這對沼氣生物反應(yīng)器的開發(fā)和應(yīng)用，以及對AME-D工藝的深入理解具有重要意義。