硝化作用是氨被微生物氧化為硝酸鹽的過程，硝化作用是自然界中連接氧化態(tài)和還原態(tài)無機(jī)氮庫的唯一生物學(xué)過程，在維持全球氮素平衡中起著關(guān)鍵作用分別由氨氧化微生物(AOB和AOA)和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB)主導(dǎo)完成。論文研究了幾種不同的經(jīng)過純培養(yǎng)的硝化細(xì)菌(Candidatus Nitrospira nitrosa、Candidatus Nitrospira nitrificans和Candidatus Nitrospira inopinata)和一種未經(jīng)過純培養(yǎng)的細(xì)菌(類Nitrospira)，它們都具備單獨(dú)將氨氧化為硝酸鹽的能力，這些微生物被定義為全程氨氧化微生物(Comammox)。本論文主要就微生物的硝化反應(yīng)動力學(xué)過程進(jìn)行相關(guān)研究，研究過柱中主要應(yīng)用了微呼吸系統(tǒng)結(jié)合氧電極測試這幾種硝化微生物菌的硝化過程以及結(jié)合測試體系中氧濃度的變化情況來判斷這些微生物菌在低營養(yǎng)環(huán)境中的硝化反應(yīng)的動力學(xué)

Unisense微電極分析系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用unisense微電極分析系統(tǒng)測試，結(jié)合一個2ml的玻璃微呼吸瓶，其中使用微呼吸氧電極的尖端為500um，其中氧電極在使用前已經(jīng)極化了7天，其中玻璃材質(zhì)的微呼吸瓶放置在循環(huán)水浴鍋中，使用氧氣微電極測試生物的微呼吸速率。其中食心蟲網(wǎng)螟微生物的微呼吸測試的環(huán)境溫度為37度，螨蟲的呼吸速率是在42度的環(huán)境下，微呼吸瓶中放有培養(yǎng)基，培養(yǎng)基靠近微呼吸瓶的注釋器的針尖端，這樣可以確保微呼吸瓶中的不會形成頂部空間，微呼吸瓶中還放有攪拌子，攪拌速度為200-400rpm的轉(zhuǎn)速。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

銨鹽和亞硝酸鹽氧化被認(rèn)為是通過氨氧化細(xì)菌（AOB）以及氨氧化古菌(AOA)和亞硝酸鹽氧化菌共同作用完成的。研究發(fā)現(xiàn)硝化螺菌屬有全程氨氧化菌(comammox)，該菌屬可以獨(dú)將氨轉(zhuǎn)化成硝酸鹽，孤立的進(jìn)行comammox細(xì)菌和inopinata硝化螺菌屬的純培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)他們能夠適應(yīng)于貧瘠和動態(tài)棲息地環(huán)境下緩慢生長，是基于這類菌對氨的高親和力和低的最大氨氧化速率，而與規(guī)范氮化物收益率相比具有高增長率，替代新陳代謝的基因潛力。對來自于土壤的和溫泉AOA菌的硝化動力學(xué)比較。我們發(fā)現(xiàn)AOA與全程氨氧化菌(comammox)相比，在貧營養(yǎng)的環(huán)境中并不具備很好的氨氧化性能，而N.inopinata菌與銨鹽底物具有很好的親和力.這表明全程氨氧化微生物（comammox）在貧瘠和動態(tài)環(huán)境條件下能夠發(fā)生硝化作用,能夠?qū)@鹽直接轉(zhuǎn)換為硝酸鹽。

圖1、N.inopinata細(xì)菌和三種氨氧化奇古菌的氨的氧化動力學(xué)研究。a-d代表的是不同氨氧化菌的中在不同濃度的氨鹽環(huán)境下的氨氧化速率。其中圖a表示的是N.inopinata細(xì)菌，圖b表示的是Nirospira gargensis氨氧化菌，圖c表示的是Nirospira viennesis菌；圖d表示的是Ca Nitrosotenuis uzonesis菌。從圖中可以看出，隨著氨鹽濃度的增加，不同氨氧化菌進(jìn)行氨氧化的速率呈現(xiàn)非線性關(guān)系，先增長后慢慢趨于平衡。而體系中銨的濃度檢測是基于氧消耗計(jì)算出來的。

圖2、N.inopinata菌的亞硝酸鹽氧化動力學(xué)研究。亞硝酸鹽的氧化速率是基于亞硝酸微傳感器計(jì)算出來的，而亞硝酸微傳感器是通過微呼吸電極測試環(huán)境中的氧的消耗情況以及培養(yǎng)基底物濃度的變化斜率換算出亞硝酸鹽的濃度變化。其中半飽和參數(shù)和亞硝酸鹽的最大銨氧化速率是結(jié)合Michaelis-Menten反應(yīng)動力假說方程非線性擬合得出的。其中紅色的線代表的是擬合線，圓點(diǎn)代表的是實(shí)際測試數(shù)據(jù)點(diǎn)。

圖3、不同的總銨濃度對于三種氨氧化菌（Nitrospira inopinata,Nitrososphaera gargensis,Nitrosospira spp）的氨氧化速率的影響。其中氨氧化速率是通過氨氧化動力反應(yīng)過程來表達(dá)的。其中Nitrospira inopinata菌和Nitrososphaera gargensis菌的氨氧化速率是基于動力學(xué)參數(shù)計(jì)算獲得的。Km(app)（半飽和參數(shù)）and Vmax（最大銨氧化速率）是基于Michaelis-Menten反應(yīng)動力假說方程非線性擬合獲得的。

圖4、N.inopinata isolate菌的掃描電鏡形態(tài)圖以及其硝化活性性能分析。其中圖a表示的是N.inopinata isolate菌的掃描電鏡形態(tài)圖，從圖中可以看出，該菌的直徑大約為0.2~0.3微米，圖b表示的不同時間段內(nèi)的1mM的銨鹽轉(zhuǎn)換為硝酸鹽以及其中間產(chǎn)物亞硝酸鹽的近化學(xué)計(jì)量比圖。該圖是經(jīng)過了三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后獲得的。

圖5、N.inopinata and N.gargensis菌的氨氧化活性的最佳溫度。其中圖a表示的是N.inopinata菌在不同溫度環(huán)境下的氨氧化活性研究。圖b表示的是N.gargensis菌在不同溫度環(huán)境下的氨氧化活性研究。從圖中可以看出，N.inopinata菌的氨氧化活性最適宜溫度是37度，而N.gargensis菌的最佳適宜溫度是46度。

Unisense微電極分析系統(tǒng)在研究中發(fā)揮的作用：

本論文主要是就微生物的單步硝化和全程氨氧化作用的過程及硝化反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行了相關(guān)研究，研究了硝化螺菌屬下屬的三種全程氨氧化菌（cmammox）的硝化反應(yīng)的動力學(xué)研究，論文主要是就體系中的總氨的濃度變化來判斷微生物菌硝化反應(yīng)的動力學(xué)過程，具體方法是將相關(guān)全程氨氧化菌微生物放置于2ml的微呼吸瓶中，同時配合unisense公司開發(fā)的氧微呼吸電極，用于檢測微呼吸瓶中氧的濃度變化情況，通過氧濃度的變化換算出體系中微呼吸瓶的頂端密封有一個可以添加物質(zhì)的針頭，用于補(bǔ)加胺鹽或亞硝鹽類物質(zhì)，這也方便了可以進(jìn)行不同銨鹽的含量對于全程氨氧化菌微生物的硝化性能的影響。微呼吸系統(tǒng)用于微生物的硝化反應(yīng)動力學(xué)的研究是一個很好的研究創(chuàng)新，發(fā)揮了微電極分析系統(tǒng)能夠?qū)崟r監(jiān)測、精度高、相應(yīng)快的優(yōu)點(diǎn)，這也首次開拓了unisense微電極分析系統(tǒng)在微生物的硝化動力學(xué)的領(lǐng)域研究。

總結(jié)

硝化、氨氧化(NH3)形成亞硝酸鹽(NO2?）氧化形成硝酸鹽(NO3?),這個過程是地球化學(xué)氮的生物循環(huán)的一個關(guān)鍵過程。單步硝化作用和全程氨氧化微生物的發(fā)現(xiàn)終結(jié)了傳承百年的分布硝化理論，并引發(fā)了眾多關(guān)于全球氮素循環(huán)的重要科學(xué)問題，如這些微生物在環(huán)境中的生態(tài)位點(diǎn)及其在硝化作用中的相對貢獻(xiàn)等．本論文就幾種全程氨氧化細(xì)菌的單步硝化作用及其硝化動力學(xué)方面展開了相關(guān)研究，研究過程中使用了unisense的氧微呼吸，通過監(jiān)控氨氧化細(xì)菌在硝化過程中的氧的消耗來換算出體系中氨的損耗，從而全面解析這類全程氨氧化細(xì)菌（comammox）在低營養(yǎng)環(huán)境下的完整硝化反應(yīng)過程及硝化動力學(xué)的研究，從整理論文的研究可以看出，正是因?yàn)槭褂昧藆nisense微呼吸研究系統(tǒng)可以全面的檢測環(huán)境中的氧消耗濃度的變化，從而能夠準(zhǔn)確的換算出體系中氨的消耗情況，從而能夠?qū)@類微生物的硝化反應(yīng)動力學(xué)過程進(jìn)行研究，該微電極分析系統(tǒng)研究微生物的硝化動力學(xué)研究中可以在實(shí)驗(yàn)過程中補(bǔ)充銨鹽類物質(zhì)，并且不會影響體系中氧的消耗，這也說明該微電極分析系統(tǒng)在微生物硝化反應(yīng)動力學(xué)過程研究方面存在非常好的應(yīng)用。